Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru


  


2017 год
3 номер

О Журнале

Текущий год
Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

https://pornoseksxxx.com/

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2007, № 2

Подписаться на 2018 год

Заказать этот номер

Заказать эту статью в PDF

На правах рекламы

Номер 2'2007

СРАВНЕНИЕ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА 1БЕТА И ИНТЕРЛЕЙКИНА 6 ДВУХ РАЗЛИЧНЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева

С целью расширения номенклатуры выпускаемых диагностических наборов в ЗАО "Вектор-Бест" была проведена разработка двух новых наборов реагентов для количественного определения интерлейкина 1бета (IL-1β) и интерлейкина 6 (IL-6) человека методом иммуноферментного анализа (ИФА). С началом их производства перечень наборов для ИФА цитокинов в каталоге продукции предприятия возрос до 9 наименований.

Интерлейкин 1бета относится к семейству интерлейкина 1, вместе с TNFα и IL-6 входит в группу провоспалительных цитокинов и играет центральную роль в локальном и системном, остром и хроническом воспалении [5]. IL-1β представляет собой полипептид с молекулярной массой 17 кДа, который преимущественно продуцируется макрофагами и фагоцитами (в меньшей степени лимфоцитами, фибробластами, эпителиальными клетками). IL-1β инициирует и регулирует воспалительные и иммунные процессы, активирует нейтрофилы, Т- и В-лимфоциты, стимулирует синтез белков острой фазы, цитокинов, молекул адгезии, простагландинов. Он также повышает хемотаксис, фагоцитоз, гемопоэз, проницаемость сосудистой стенки, цитотоксическую и бактерицидную активность, стимулирует синтез коллагена. Кроме того, IL-1β служит медиатором взаимодействий между иммунной и нервной системами, участвует в формировании костной ткани, секреции инсулина, регулировании аппетита, развитии лихорадки [4].

Синтез IL-1β в организме человека, как правило, происходит в ответ на бактериальную инфекцию, действие микробных токсинов, воспалительных агентов, активированных компонентов комплемента или системы свертывания крови, а также других цитокинов [5]. Повышение содержания IL-1β в крови отмечено при обострении панкреатита, язвенной болезни, вирусного гепатита, болезни Крона, пневмокониозе, туберкулезе и др. [3]. Кроме того, у больных с ревматоидным артритом его уровень возрастает в синовиальной жидкости, а у пациентов после неврологических воспалений или инсультов - в цереброспинальной жидкости. Содержание IL-1β в сыворотке крови здоровых людей не превышает 6 пг/мл.

Результаты изучения спонтанного и индуцированного митогенами синтеза IL-1β мононуклеарами периферической крови (МПК) показали, что его продукция in vitro в культуре клеток и ex vivo в цельной крови у пациентов с различными заболеваниями отличается. Она повышена при бактериальных инфекциях: пневмокониозе, саркоидозе, туберкулезе; и понижена у больных с атопиями, раком легкого, респираторными вирусными инфекциями [2]. Мононуклеары периферической крови здоровых доноров (106 клеток/мл) могут спонтанно продуцировать IL-1β от 2 до 250 пг/мл, а при индукции фитогемагглютинином (ФГА) - 200-2500 пг/мл.

Интерлейкин 6 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 26 кДа, является плейотропным цитокином, координирующим иммунный и острофазный воспалительный ответы, а также онкогенез и гемопоэз [6]. Синтез IL-6, осуществляемый как лимфоидными, так и нелимфоидными клетками (лимфоцитами, макрофагами, фибробластами, гепатоцитами, васкулярными, эндотелиальными, опухолевыми и др.), стимулируют митогены, липополисахариды, IL-1, TNFα и вирусы. Одна из основных функций IL-6 состоит в регуляции процессов созревания антителообразующих клеток и продукции ими иммуноглобулинов. IL-6 участвует в активации Т-лимфоцитов, индуцирует синтез многих острофазных белков: фибриногена, альфа1-антихимотрипсина, гаптоглобина, сывороточного амилоида А, С-реактивного белка и др. Кроме того, он способен ингибировать синтез провоспалительных цитокинов (IL-1β и TNFα), может оказывать гормоноподобное действие на печень, поддерживая гомеостаз глюкозы [2].

Повышенные уровни IL-6 наблюдаются при многих патологических состояниях человека, таких как артрит и болезнь Кастлемана, гломерулонефрит, псориаз, воспаление кишечника, злокачественные плазмоцитома, миелома, лимфома, лейкемия, рак яичников. Его концентрация также возрастает при травмах или обширных хирургических операциях, ишемии и ожогах. Содержание IL-6 в сыворотке крови человека коррелирует с индексом массы тела, а также возрастает при ожирении и атеросклерозе. IL-6 может повышать сывороточный уровень триглицеридов и глюкозы, а также стимулировать гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему, активность которой играет важную роль при заболеваниях, связанных с нарушениями обмена веществ [2, 3, 6]. Содержание IL-6 в сыворотке крови здоровых людей не превышает 10-15 пг/мл. Спонтанная продукция IL-6 МПК здоровых доноров (106 клеток/мл) составляет от 2 до 600 пг/мл, ФГА-индуцированная продукция - 9000-30000 пг/мл.

Мониторинг концентрации сывороточных цитокинов IL-1β, IL-6 и их спонтанной и митоген-индуцированной продукции клетками крови больных в ходе противовирусной, антибактериальной или иммуномодулирующей терапии позволяет оценить эффективность проводимого лечения и при необходимости скорректировать его.

Целью настоящей работы было предварительное испытание наборов реагентов "ИЛ-1бета-ИФА-Бест" и "ИЛ-6-ИФА-Бест", в том числе их сравнение с импортными тестами аналогичного назначения по некоторым основным параметрам.

Сложность проведения таких исследований состояла в том, что в настоящее время не существует аттестованных контрольных материалов с точно определенной концентрацией данных цитокинов. Поэтому для проведения этой работы были использованы образцы сыворотки крови доноров, а также панель положительных образцов (ППО), которая была нами приготовлена при разведении в 10 и 100 раз отрицательной донорской сывороткой супернатантов, полученных при индуцированной ФГА продукции цитокинов клетками цельной крови пациентов [1].

В качестве тестов сравнения использовали наборы реагентов "Quantikine Human IL-1βeta Immunoassay" и "Quantikine Human IL-6 Immunoassay" фирмы "R&D Systems", Great Britain ("RnD"). В результате исследования с их помощью ряда образцов сыворотки крови доноров были созданы 3 рабочие панели сывороток: I - с концентрацией IL-1β ниже 3,9 пг/мл, II и III - с содержанием IL-6 меньше и больше 3,12 пг/мл, соответ-ственно. Такие концентрации IL-1β и IL-6 имеют нижние калибровочные образцы наборов фирмы "RnD", и они же являются минимальными (пороговыми) уровнями этих цитокинов, определяемыми в анализируемых пробах при использовании данных наборов.

При исследовании I рабочей панели сывороток с помощью набора "ИЛ-1бета-ИФА-Бест" концентрация этого цитокина в каждом из 21 образца была менее 3 пг/мл. Содержание IL-6 в 26 сыворотках II панели, определенное при использовании набора "ИЛ-6-ИФА-Бест", находилось в диапазоне 0,0-2,7 пг/мл. Таким образом, полученные данные показали, что анализ сывороток крови, содержащих IL-1β и IL-6 в концентрациях ниже минимальных пороговых уровней наборов "RnD", с использованием разработанных наборов реагентов "ИЛ-1бета-ИФА-Бест" и "ИЛ-6-ИФА-Бест" дает близкие результаты.

Для изучения корреляции между результатами определения IL-1β, получаемыми при проведении ИФА с набором реагентов "ИЛ-1бета-ИФА-Бест" и набором-аналогом "RnD", были протестированы 19 образцов ППО с различной концентрацией данного цитокина. Как видно из диаграммы рассеяния (рис. 1), результаты исследования ППО, полученные при использовании двух наборов, хорошо совпадают (коэффициент корреляции r  =  0,999).

Результаты анализа 18 сывороток III панели с концентрацией IL-6 в интервале 3,12-43,80 пг/мл и 8 образцов ППО, полученные при использовании наборов "ИЛ-6-ИФА-Бест" и "RnD" (рис. 2), также хорошо коррелировало (r = 0,995).

Чувствительность анализа (минимальную определяемую концентрацию, Смин) вычисляют по калибровочному графику либо по соответствующей программе, исходя из оптической плотности - ОПСmin, рассчитанной по формуле:

ОПСmin = ОП0ср + 2σ,

где: ОП0ср - среднее арифметическое значение ОП в 12 лунках с нулевой калибровочной пробой;

σ - среднее квадратичное отклонение от ОП0ср.

Чувствительность набора реагентов "ИЛ-1бета-ИФА-Бест" составила 0,49 пг/мл (соответствующий показатель для набора "RnD", приведенный в его паспорте, - 1,00 пг/мл), а набора "ИЛ-6-ИФА-Бест" - 0,43 пг/мл (набор-аналог "RnD" - 0,70 пг/мл, по паспортным данным).

В рамках настоящей работы была также проведена предварительная клиническая проверка новых наборов реагентов ЗАО "Вектор-Бест". Они были использованы для определения концентрации сывороточных IL-1β и IL-6 у условно здоровых доноров крови в возрасте 20-50 лет из Новосибирской области и Алтайского края. Средняя концентрация IL-1β в сыворотке крови 125 обследованных доноров составила 1,6 пг/мл (от 0 до 11,2 пг/мл), причем у 116 (92,8 %) человек она была ниже 5 пг/мл. Средняя концентрация IL-6 для 46 доноров составила 3,2 пг/мл (0-28 пг/мл), а у 42 (91,3 %) из них была ниже 10 пг/мл.

Кроме того, у 32 условно здоровых доноров крови с использованием наборов реагентов "ИЛ-1бета-ИФА-Бест" и "ИЛ-6-ИФА-Бест" была исследована спонтанная и стимулированная митогеном продукция данных цитокинов клетками цельной крови. С этой целью пробу крови пациентов забирали утром натощак в пробирки с гепарином натрия, разводили в 5 раз средой DMEM M, содержащей гепарин (2,5 ЕД/мл), гентамицин (100 мкг/мл), L-глютамин (0,6 мг/мл), и культивировали при 37 °C 24 ч. Для стимуляции продукции цитокинов перед культивированием добавляли 10 мкг/мл ФГА [6]. Спонтанная продукция IL-1β клетками крови доноров варьировала в интервале от 6 до 250 пг/мл, а стимулированная ФГА - 270-2360 пг/мл. Для IL-6 соответствующие показатели составили 8-365 и 9600-29500 пг/мл.

Проведенные исследования показали, что результаты определения цитокинов IL-1β и IL-6 в пробах с их различным содержанием, полученные с применением наборов реагентов "ИЛ-1бета-ИФА-Бест" и "ИЛ-6-ИФА-Бест" и аналогичных наборов фирмы "R&D Systems" хорошо коррелируют (r  =  0,999 и 0,995, соответственно). Чувствительность новых наборов ЗАО "Вектор-Бест", по крайней мере, не уступает наборам "RnD". Таким образом, наборы реагентов "ИЛ-1бета-ИФА-Бест" и "ИЛ-6-ИФА-Бест" могут быть успешно использованы в лабораторной практике для определения сывороточных IL-1β и IL-6, а также для измерения их спонтанной и митоген-индуцированной продукции клетками крови человека.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала
!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2018 Цитокины и Воспаление