Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 234 16 69, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 234 94 89
E-mail:
Web: cytokines.ru


  


2008 год
1 номер 2 номер
3 номер 4 номер

О Журнале

Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:


https://pornoseksxxx.com/

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2002, № 4

Подписаться на 2009 год

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 4'2002

ВЫРАБОТКА ИНТЕРФЕРОНА G И ИНТЕРЛЕЙКИНА 4 ТИМОЦИТАМИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

Н.И. Шарова, М.М. Литвина, С.В. Шевелев, А.Х. Дзуцев, А.А. Ярилин

Примерно каждый четвертый тимоцит, выделенный из тимуса детей первого года жизни, содержит в цитоплазме IFNg, а каждый шестой - IL-4. Часть тимоцитов несет указанные цитокины на своей поверхности. IFNg присутствует в основном в зрелых тимоцитах, а также в CD4-CD8- клетках-предшественниках, а IL-4 - в незрелых клетках фенотипов CD4-CD8- и CD4+CD8+. Культивирование тимоцитов в течение суток без активаторов приводит к снижению числа цитокинсодержащих клеток (за одним исключением: повышается доля IFNg+ CD4+CD8+ клеток), что, вероятно, обусловлено деградацией цитокинов внутри клеток. Активация тимоцитов путем культивирования в течение 1 сут. в присутствии форболмиристатацетата (ФМА) и иономицина не влияла на численность IFNg+ и IL-4+ клеток. Однако контакт тимоцитов с тимусными эпителиальными клетками значительно повышал число IL-4+ клеток, а при дополнительном действии ФМА и иономицина - также IFNg+ клеток.

Как известно, интерферон g (IFNg) и интерлейкин 4 (IL-4) являются ключевыми цитокинами, продуцируемыми Т-хелперными клетками типов Th1 и Th2 [11], и по своему биологическому действию во многих отношениях выступают в качестве антагонистов. Сказанное в полной мере проявляется в периферическом отделе иммунной системы при выработке этих цитокинов стимулированными зрелыми Т-лимфоцитами. Условия образования этих цитокинов в тимусе существенно иные.

Это обусловлено прежде всего двумя обстоятельствами: 1) тимоциты представляют собой смесь Т-клеток, находящихся на разных стадиях развития, причем на долю зрелых клеток приходится всего около 15 % от их числа; 2) в норме развитие иммунного ответа в тимусе практически невозможно в связи с особенностями его структуры, клеточного состава и ограниченным поступлением антигенов в его внутреннюю среду. Поскольку в тимусе отсутствуют условия для физиологической стимуляции Т-клеток, выработка цитокинов здесь подчиняется другим закономерностям, чем в периферическом отделе иммунной системы.

Тем не менее, известно, что тимоциты образуют ряд цитокинов, включая IFNg и IL-4, однако условия их выработки и проявления биологических эффектов в тимусе существенно иные, чем на периферии иммунной системы. Уже самые юные тимоциты фенотипа CD3-CD4-CD8- способны продуцировать небольшие количества цитокинов, причем для выработки IFNg требуется стимуляция этих клеток (например, смесью форболового эфира и кальциевого ионофора [13]), тогда как выработка IL-4 индуцируется даже простым контактом с тимусными эпителиальными клетками (ТЭК) [5]. При дальнейшем созревании тимоцитов в CD4+CD8+ клетки способность экспрессировать гены цитокинов блокируется [14]. Лишь после успешного осуществления положительной селекции и перехода со стадии CD3lo на стадию CD3hi способность клеток вырабатывать IFNg восстанавливается [11]. В то же время сообщалось о том, что выработка IL-4 при этом, наоборот, ослабляется [2]. Показано, что и в зрелых CD4+CD8- тимоцитах с большей легкостью удается индуцировать синтез IL-4, чем IFNg: для выработки ими IL-4 необходимо воздействие на Т-клеточный рецептор (например, моноклональными антителами к CD3) в сочетании с костимуляцией антителами к CD28 или действием форболмиристатацетата (ФМА), тогда как для индукции выработки IFNg дополнительно требуется действие IL-12 [6, 12]. С другой стороны, СD4-СD8+ тимоциты при активации через CD3/TCR и костимуляции секретируют IFNg, а для индукции выработки IL-4 требуется дополнительное действие самого IL-4 [11].

Приведенные данные получены преимущественно путем оценки экспрессии мРНК соответствующих цитокинов или определения секретируемого цитокина в культуральном супернатанте тимоцитов (практически исключительно мышиных) с помощью иммуноферментного метода. Между тем при изучении выработки цитокинов периферическими Т-лимфоцитами очень продуктивным подходом оказалось определение цитокинпродуцирующих клеток путем цитофлуорометрического выявления цитокинов в их цитоплазме в условиях блокады процесса транспорта и, следовательно, секреции белков [4].

Мы применили данный подход к анализу способности тимоцитов человека продуцировать IFNg и IL-4 при их культивировании в условиях стимуляции или при контакте с ТЭК, в частности, на фоне блокады синтеза РНК или транспорта белков. При этом обнаружились существенные отличия условий выработки и секреции этих цитокинов тимоцитами от условий их образования зрелыми периферическими Т-лимфоцитами.

Материалы и методы

Тимоциты получали из фрагментов тимуса детей первого года жизни; фрагменты тимуса иссекали во время операций по поводу врожденных пороков сердца (Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева, Москва) в соответствии с принятой операционной тактикой. Из первичной культуры тимусных фрагментов получали ТЭК, подвергавшиеся перед исследованием 3-4 пассажам in vitro [1].

Тимоциты фракционировали с использованием наборов магнитных шариков "CD8 Positive Isolation Kit" и "CD4 Positive Isolation Kit" (Dynal) по стандартной методике, предложенной фирмой-производителем. Для этого суспензию тимоцитов добавляли к магнитным шарикам в соотношении 1:4 и в течение 20 мин инкубировали при 4 °С. Затем суспензию клеток помещали в магнитное поле, в котором и осуществлялось разделение клеток. После выделения клетки освобождали от шариков с помощью энзиматической обработки. Для получения CD4+CD8+ процедуру селекции клеток на шариках осуществляли дважды. После отмывок фракции тимоцитов использовали в опытах.

Тимоциты культивировали в течение суток в концентрации 1 _ 106 в мл в питательной среде RPMI c добавлением эмбриональной сыворотки (Flow; 10 %), L-глутамина (Flow; 300 мкг/мл) и HEPES-буфера (Sigmа; 0,02 М). В опытах с сокультивированием клеток тимоциты наслаивали на монослой адгезивного эпителия [10].

Для активации клеток их инкубировали в течение суток в присутствии форболмиристатацетата (ФМА, Sigma; 10 нг/мл) и иономицина (Sigma; 2 мкМ) в присутствии GolgiPpug (Beсton Dickinson; 1 мкг/мл).

Для определения в тимоцитах внутриклеточных цитокинов [4] использовали соответствующие МонАТ и проточную лазерную цитометрию. В работе использовали МонАТ к INFg, меченные флуоресцеинизотиоцианатом, и МонАТ к IL-4, меченные фикоэритрином (Caltag). Тимоциты фиксировали 2 %-ным параформальдегидом в течение 20 мин при температуре 4 °С, затем пермеабилизировали 0,5 %-ным сапонином 20 мин при 4 °С. Не отмывая от сапонина, добавляли МонАТ в количестве, рекомендованном фирмой-производителем. Клетки отмывали забуференным физиологическим раствором, рН 7,4, с 2 % сапонина и 1 % BSA. При определении мембранных цитокинов пермеабилизацию клеток сапонином не проводили.

Анализ образцов осуществляли на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson) с аргоновым лазером (длина волны 488 нм) на основе определения четырех параметров: малоуглового светорассеяния (FCS) и бокового светорассеяния (SSC) и двух показателей флуоресценции - зеленой (флуоресцеин изотиоцианат - ФИТЦ - 530 нм) и оранжевой (фикоэритрин - ФЭ - 585 нм). В координатах FCS и SSC вычленяли гейт тимоцитов (мелкие клетки со слабой гранулярностью) и анализировали их одновременно на наличие зеленой и оранжевой флуоресценции для выявления клеток, содержащих INFg и IL-4.

Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2002 и 2003 годы!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2006 год.


Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2007 год.


© 2002-2009 Цитокины и Воспаление