Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2003, № 1
|
Оригинальные статьи
|
Номер 1'2003
|
КАСПАЗОНЕЗАВИСИМЫЙ ПУТЬ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА, ИНДУЦИРОВАННЫЙ TNFA
Н.А. Маянский, Д. Роос, Т. Кайперс
Цель - изучить механизмы клеточной гибели нейтрофилов, индуцированной TNFa. Материалы и методы. Клеточную гибель нейтрофилов, вызванную TNFa при отсутствии или добавлении ингибитора каспаз zVAD-fmk и ряда антиоксидантов, исследовали при помощи проточной цитофлуориметрии клеток, окрашенных аннексином-V/PI, и анализа цитоспинов. Активацию каспаз-8 и -3 регистрировали путем иммуноблоттинга, ДНК-"лестницу" выявляли при электрофорезе ДНК в агарозном геле, анализ митохондрий и белка Вах проводили c помощью флуоресцентной микроскопии. Цитопласты нейтрофилов получали при ультрацентрифугировании в прерывистом градиенте плотности. Результаты. TNFa вызывал апоптозную гибель нейтрофилов в 6-часовых культурах, которая сопровождалась активацией каспаз-8 и -3. Вместе с тем при ингибировании каспаз zVAD-fmk воздействие TNFa по-прежнему вызывало клеточную гибель нейтрофилов. Данный тип клеточной гибели не обнаруживал типичных для апоптоза ядерных изменений и перераспределения Вах, но демонстрировал кластеризацию митохондрий и изменения цитоплазматической мембраны, схожие с апоптозными. Эксперименты с утилизатором активных форм кислорода (АФК) и специфическим ингибитором митохондриального дыхания, а также с цитопластами нейтрофилов, лишенными митохондрий, показали, что клеточная гибель нейтрофилов после воздействия TNFa+zVAD-fmk опосредуется через АФК митохондриального происхождения. Заключение. Воздействуя на нейтрофилы человека, TNFa способен индуцировать два пути клеточной гибели: "классический" каспазозависимый апоптоз и "неклассическую" каспазонезависимую клеточную гибель.
Туморонекротический фактор a (TNFa) обеспечивает широкий спектр биологических сигналов, участвующих в регуляции иммунного гомеостаза [23], в том числе и через управление клеточной гибелью. Будучи одним из важнейших провоспалительных цитокинов, TNFa в ряде экспериментальных моделей обнаруживал антивоспалительный эффект [11, 14], который может быть частично обусловлен индукцией апоптоза нейтрофилов. Этот вид клеточной гибели позволяет удалять потенциально опасные нейтрофилы из очагов воспаления и способствует их ограничению, поскольку фагоцитоз апоптозных клеток резидентными макрофагами оказывает иммуносупрессивный эффект [20]. Апоптозное действие TNFa связано с активацией каскада апоптозных протеаз, называемых каспазами. Сигнал гибели передается с рецептора TNFa внутрь клетки через ряд адапторных белков, которые организуют комплекс с одной из инициаторных каспаз - каспазой-8, что ведет к активации последней. Активная каспаза-8 способствует включению эффекторных каспаз, завершающих апоптозную программу [3]. В связи с этим вполне логичными представляются данные, показывающие, что ингибирование каспаз значительно повышает выживаемость различных типов клеток, в том числе и нейтрофилов, за счет задержки апоптоза [13].
Исследуя влияние TNFa на апоптоз нейтрофилов, мы столкнулись с неожиданным феноменом. Было обнаружено, что, несмотря на то что каспазы играют центральную роль в апоптозе нейтрофилов, ингибрование каспаз в присутствии TNFa не предотвращало гибель клеток, а, напротив, усиливало ее. В настоящей работе описывается этот каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов, отличающийся от "классического" апоптоза по ряду признаков, а также предлагаются его вероятные механизмы.
Материалы и методы
Реактивы: TNFa - Calbiochem (Германия); zVAD-fmk - Alexis Biochemicals (США); аннексин-V - Bender Medsystems (Австрия); MitoTracker Green FM - Molecular Probes (США). Антитела (Ат): против Вах и каспазы-3 - Pharmingen (США); каспазы-8 - Cell Signaling (США). Другие реактивы, если не указано иное, были приобретены у Sigma (США). Методики выделения и культивирования нейтрофилов и цитопластов, определения уровня апоптоза, иммуноблоттинга, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) детально описаны ранее [1, 2, 13]. Электрофорез ДНК, выделенной из 5?106 нейтрофилов при помощи набора PureGene DNA isolation kit (Gentra Systems, США) в соответствии с рекомендациями производителя, проводили в 1,2 %-ном агарозном геле, содержащем этидиум бромид, после чего гель фотографировали в ультрафиолетовом свете. Статистическую обработку результатов выполняли при помощи ANOVA (one-way analysis of variance) с последующим пост-тестом Бонферрони, используя компьютерную программу GraphPad Prism v. 3.0. Статистически значимыми различия считали при р " 0,05.
Результаты и обсуждение
Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2002 и 2003 годы!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!
Начата подписка на 2011 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
