Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2003, № 1
|
Оригинальные статьи
|
Номер 1'2003
|
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА ПРИ ОСТРОМ ЛИМФОБЛАСТНОМ ЛЕЙКОЗЕ У ДЕТЕЙ
М.П. Потапнев, Н.В. Петевка, М.В. Белевцев, В.П. Савицкий, Т.В. Шман, В.В. Гринев, Н.В. Мигаль
Изучена связь уровня фактора некроза опухолей альфа (TNFa) с клинико-лабораторными параметрами В-линейного острого лимфобластного лейкоза у детей. Выявлена позитивная корелляционная связь уровня TNFa в плазме крови с содержанием бластных (лейкозных) клеток в периферической крови (ПК) (r = 0,493; p = 0,0003), но не костном мозге больных. Одновременно наблюдалась отрицательная корреляционная зависимость содержания TNFa и биологических свойств лейкозных клеток - уровня пролиферации и апоптоза. У пациентов с уровнем TNFa выше значения медианы (26 пг/мл) наблюдались более высокие значения содержания лейкозных клеток в ПК, содержания противоопухолевых антител, более низкие значения содержания пролиферирующих (находящихся в S-фазе) и апоптотических лейкозных клеток по сравнению с показателями у больных с уровнем TNFa ниже значения медианы. Не выявлена связь частоты инфекций, неблагоприятного ответа на терапию, уровня 3-летней выживаемости с концентрацией цитокина выше или ниже значения медианы. Сделано заключение о том, что повышенный уровень TNFa в крови ассоциирован с усилением периферизации лейкозных клеток и изменением их пролиферации и чувствительности к апоптозу.
Ключевые слова: фактор некроза опухолей альфа, острый лимфобластный лейкоз, дети.
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является наиболее частым онкологическим заболеванием у детей [14]. Без проведения специфического лечения болезнь в 100 % случаев приводит к смерти, в то же время современные протоколы химиотерапии обеспечивают излечение 70-80 % детей с ОЛЛ. Дальнейшее повышение выживаемости больных, как считается, зависит от учета патогенетически значимых биологических параметров организма пациента и опухолевых клеток [14]. В качестве таких параметров выступают и цитокины, продуцируемые преимущественно организмом больного ОЛЛ. Фактор некроза опухолей альфа (TNFa) является одним из наиболее ранних цитокинов, продуцируемых при многих патологических состояниях человека и животных. К настоящему времени накоплено немало подтверждений того, что TNFa участвует в патогенезе многих онкогематологических заболеваний человека. Уровень данного цитокина в плазме, сыворотке крови больных ОЛЛ детей, как показано, коррелирует с клиническими проявлениями и исходом заболевания [5, 10]. Несмотря на то, что изменение уровня TNFa традиционно связывают с воспалительным процессом, при онкогематологических заболеваниях повышенный уровень сывороточного TNFa связан с прогрессией основного заболевания и не зависит от наличия инфекционно-воспалительных процессов [2, 5, 15].
В связи с этим целью проведенного исследования было установление зависимости клинико-лабораторных проявлений, биологических свойств опухолевых клеток и ответа на стандартную химиотерапию от уровня TNFa в плазме крови детей с ОЛЛ.
Материалы и методы
Обследовано 49 больных детей в возрасте от 3 до 17 лет (медиана 9,5), впервые поступивших на лечение в РНПЦДОГ в период 1998-2001 гг. с диагнозом "В-линейный острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ)". Больным было проведено в полном объеме гематологическое, морфологическое, цитохимическое, цитогенетическое, иммунофенотипическое и молекулярно-биологическое обследование для верификации диагноза и стратификации группы риска для определения тактики лечения. Все больные получали лечение по программе БФМ-90-М. Критериями благоприятного ответа на проводимую терапию было обнаружение менее 1000 опухолевых клеток в 1 мкл периферической крови (ПК) на 8-й день терапии и содержание менее 5 % бластных клеток в костном мозге (КМ) больных на 15-й день лечения.
Контрольную группу составили 46 детей, проживающих в детской деревне Kinder SOS Минского района, обследованных в рамках ежегодных диспансерных наблюдений в РНПЦ ДОГ. Возраст здоровых детей составлял от 3 до 15 лет (медиана 8,0).
Плазму и сыворотку крови больных и здоровых детей собирали при проведении стандартного обследования, образцы сразу центрифугировали во избежание гемолиза и хранили при -70 °C до проведения исследований. Уровень TNFa определяли иммуноферментным методом, как описано ранее [1]. Чувствительность определения составляла 15 пг/мл.
Пролиферацию и апоптоз лейкозных клеток оценивали с клетками КМ. Для этого взвесь ядерных клеток КМ, стабилизированную ЭДТА, наслаивали на градиент плотности "Гистопак" (Sigma), центрифугировали при 1500 об/мин. Мононуклеарные клетки (МНК) интерфазы собирали, отмывали и использовали для исследования. По данным иммунофенотипирования, не менее 95 % МНК были лейкозными клетками. Для оценки пролиферативной активности МНК фиксировали в 70 %-ном этаноле, затем окрашивали пропидиум иодидом (PI, Sigma, 50 мкг/мл) в присутствии РНКазы (Sigma, 150 ЕД/мл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла (G0/G1, S, G2+M) проводили методом проточной цитометрии. Измерения проводили на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson/BD). Процент позитивных клеток рассчитывали по ДНК-гистограммам с использованием программы CellFit (BD). МНК периферической крови здоровых людей использовали в качестве внутреннего стандарта клеток G0/G1 фазы клеточного цикла [12]. Было проанализированно не менее 10 000 клеток в каждом образце.
Для оценки спонтанного апоптоза лейкозных клеток МНК костного мозга больных ОЛЛ культивировали в концентрации 1 млн клеток в 1 мл среды RPMI 1640, содержащей 10 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамин и антибиотики (Sigma). После 20 ч культивирования при +37 °С клетки отмывали и окрашивали PI, как описано выше. Процент апоптотических клеток определяли методом проточной цитометрии как пре-G1 пик ДНК-гистограмм с использованием программы LYSIS II (BD).
Противоопухолевые антитела в плазме периферической крови больных ОЛЛ и контрольной группы выявляли методом клеточного иммуноферментного анализа (CELISA) с использованием клеточных линий Raji и IM-9 [4]. В лунки 96-луночных круглодонных микропланшет (Costar), содержащие отмытые опухолевые клетки, вносили образцы сыворотки крови больных (и здоровых), разведенной 1:100. После инкубации в течение 1 ч при +37 °C клетки отмывали, в лунки вносили козьи антитела к IgG+IgM+IgA человека (Sigma) и вновь инкубировали. После двукратной отмывки добавляли проявляющий буферный раствор, содержащий H2O2 и ортофенилендиамин. Реакцию останавливали 10 %-ной H2SO4, оптическую плотность измеряли при 492 нм с помощью ELISA-ридера (Behring). Каждый образец сыворотки крови анализировали в триплетах.
Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрических методов анализа, включая средние значения, стандартную ошибку, медиану, минимальное и максимальное значение. Сравнение вариационных рядов проводили с использованием U-теста Манна-Уитни, корреляционного коэффициента Спирмена, c2-теста. Общую выживаемость групп больных определяли по методу Каплан-Майера. Индекс "периферизации" лейкозных клеток рассчитывали как результат деления относительного содержания (%) бластных клеток в ПК на таковой в КМ. При установлении достоверности сравнений использовали порог значений Р = 0,05.
Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2002 и 2003 годы!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Начата подписка на 2016 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
