197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2004, № 1

ОЦЕНКА ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛЫМ СЕПСИСОМ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ФЛЮОРИМЕТРИИ (BIO-PLEX-АНАЛИЗА)

А.А. Останин, О.Ю. Леплина, Е.Я. Шевела, Е.Р. Черных, В.И. Коненков

Целью работы была интегральная оценка сывороточного уровня 19 цитокинов у хирургических больных с тяжелым сепсисом, а также при клинической манифестации септического шока. При обследовании больных (n = 14) выявлены Т-клеточно-моноцитарные иммунные дисфункции, одним из механизмов развития которых является сдвиг баланса регуляторных сывороточных факторов в сторону иммуносупрессорных и противовоспалительных медиаторов. Оценка уровня цитокинов в сыворотке крови с использованием иммуноферментного и Bio-Plex-анализа показала, что по сравнению со здоровыми донорами у больных сепсисом повышено содержание IL-1Ra, общего IL-10, IL-6 и MIP-1b, тогда как концентрация провоспалительных цитокинов (IL-1b, TNFa, IL-12, IL-17) достоверно не изменялась. В отдельных случаях регистрировали высокие концентрации IL-8 (у 50 % больных), МСР-1 (28,6 %), GM-CSF (35,7 %) и G-CSF (21,4 %). Выявлена прямая взаимосвязь между уровнем IL-1Ra, общего IL-10, MIP-1b со степенью тяжести больных (APACHE-II) и выраженностью полиорганной недостаточности (SOFA). Показано, что больные с септическим шоком характеризуются наиболее глубоким угнетением митогенной реактивности Т-клеток, более низким уровнем экспрессии DR-молекул на моноцитах, выраженной иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью сывороточных факторов, а также более высоким содержанием IL-1Ra, общего IL-10, IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 и MIP-1b. Таким образом, выявленные изменения параметров иммунного и цитокинового статуса у больных с тяжелым сепсисом свидетельствуют о преобладании у них противовоспалительных и иммуносупрессорных реакций, развитие которых "маскируется" клиническими проявлениями синдрома системного воспалительного ответа. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 1. С. 20-27.)

Ключевые слова: цитокины, Bio-Plex, сепсис, шок, полиорганная недостаточность.

Гнойно-септические заболевания и осложнения представляют сферу исключительного внимания для хирургов самых разных специальностей в силу своей распространенности и высокого уровня летальности [2, 10, 21]. Как известно, возбудителем хирургических инфекций является условно-патогенная грамположительная и/или грамотрицательная микрофлора [1]. Бактериальные патогены выступают в роли триггера клеток иммунного реагирования, активация которых приводит к запуску сложного каскада цитокиновых взаимодействий, лежащих в основе развития врожденных (неспецифических) и приобретенных (специфических) реакций иммунитета. Механизмам естественной резистентности, которые являются одним из компонентов воспалительной реакции, отводят доминирующую роль в защите от условно-патогенной микрофлоры. При незначительном количестве возбудителя резерва тканевых, гуморальных и клеточных факторов, как правило, хватает для эффективной инактивации и элиминации патогена посредством его опсонизации и фагоцитоза. В случае массивной бактериальной контаминации или неэффективности локального ответа происходит диссеминация инфекции, что клинически манифестирует развитием генерализованного внутрисосудистого воспаления (сепсиса). Клиническая картина сепсиса многогранна, обусловлена токсическим поражением различных органов и тканей и может проявляться циркуляторными расстройствами, нарушениями свертывающей системы крови, кардио- и нефропатией, развитием токсического гепатита, неврологическими расстройствами и острой дыхательной недостаточностью [8]. Указанные дисфункции и нарушения лежат в основе синдрома полиорганной недостаточности (ПОН) [4, 14].

За последнее десятилетие представление о патогенезе сепсиса и ПОН существенно расширилось [5, 10, 12, 13]. Стало очевидным, что ответная реакция со стороны клеток иммунной системы на бактериальную агрессию носит двухфазный характер. Первая фаза сопряжена с продукцией провоспалительных цитокинов, участвующих в организации воспалительного ответа. Вторая обусловлена выбросом противовоспалительных медиаторов и направлена на ограничение воспаления. При этом чрезмерная выраженность или продолжительность той или иной фазы может негативно сказываться на течении и исходе заболевания. Так, например, считается, что избыточная продукция провоспалительных цитокинов может индуцировать развитие шока, тогда как пролонгированные противовоспалительные реакции сопряжены с формированием глубокой иммунодепрессии, что во многом предопределяет летальный исход на поздних этапах гнойно-септического процесса.

Следует отметить, что бимодальная концепция течения септического процесса опирается преимущественно на данные экспериментальных исследований и теоретические представления о закономерностях развития системной воспалительной реакции [12, 13]. В то же время практически полностью отсутствуют прямые доказательства взаимосвязи между характером изменений цитокинового баланса и клиническими особенностями сепсиса, в частности, связанными с манифестацией шока или формированием полиорганных нарушений. До последнего времени такая ситуация являлась объективной и во многом была обусловлена уровнем развития лабораторно-диагностической базы исследований. Понятно, что для корректной оценки состояния цитокинового баланса требуется одномоментная оценка содержания нескольких цитокинов из оппозитных подгрупп (Th1 и Th2, про- и противовоспалительных цитокинов). Определение концентрации в крови какого-то одного из них, например TNFa или IL-4, может оказаться недостаточно информативным.

В современных условиях наметился определенный прорыв в области диагностической медицины, который связан с разработкой и внедрением в практику автоматизированного анализатора нового поколения производства компании Bio-Rad (USA). Предложенная технология позволяет проводить количественное исследование до 100 различных белков и пептидов в одном тестируемом образце [15]. В частности, в настоящее время разработаны коммерческие тест-системы для определения 17 цитокинов, относящихся к различным, функционально значимым группам. Создание диагностических систем, позволяющих осуществить множественный анализ параметров цитокинового статуса человека, открывает определенные перспективы в изучении сложного каскада цитокиновых взаимодействий, вовлеченных в развитие большинства патофизиологических процессов.

Целью настоящей работы явилась интегральная оценка сывороточного уровня Th1 и Th2, про- и противовоспалительных цитокинов, хемокинов у хирургических больных с тяжелым сепсисом/ПОН, а также при клинической манифестации септического шока.

Материалы и методы

В исследование были включены 14 больных с хирургическим сепсисом (57 % мужчин и 43 % женщин, средний возраст 49,6 + 4,0 лет), находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ). При этом 86 % (12/14) пациентов были обследованы в раннем послеоперационном периоде (в среднем на 3-и сут) и двое больных - в более поздние сроки (на 7-е и 10-е сут). В сформированной группе у 5 пациентов регистрировали абдоминальный и у 3 - раневой сепсис. Кроме того, было обследовано 6 больных с гнойно-деструктивными заболеваниями бронхолегочного аппарата (абсцедирующая пневмония, пиопневмоторакс) и средостения (медиастенит).

У подавляющего большинства больных (93 %, 13/14) регистрировался эндотоксикоз тяжелой или крайне тяжелой степени. При этом в целом по группе отмечался выраженный лейкоцитоз (20,0 + 2,5 _ 109/л), значительное увеличение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) (45,2 + 3,5 мм/ч) и лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) (7,9 + 1,5 расч. ед.).

Диагноз тяжелого сепсиса определяли в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции [11] по следующим критериям: 1) наличие очага инфекции; 2) клиническая манифестация синдрома системного воспалительного ответа (SIRS); 3) наличие синдрома полиорганной недостаточности. Степень тяжести больных определяли по шкалам APACHE-II и SAPS [19, 20]. В первом случае средний балл составил 17,7 + 2,1 баллов, во втором - 13,2 + 1,2 баллов, что позволяло прогнозировать вероятную летальность на уровне 30 %. Для оценки тяжести полиорганной недостаточности использовали шкалу SOFA [3], при этом средний балл в целом по группе составил 7,3 + 1,1. В структуре органных дисфункций чаще других регистрировались дыхательная недостаточность (86 % случаев), дисфункция ЦНС (78 %), сердечно-сосудистая недостаточность (43 %) и относительно реже почечная и печеночная дисфункции (35,5 и 7,5 % случаев соответственно). В группе больных, вошедших в исследование, 6 человек было обследовано на пике клинической манифестации септического шока.

В послеоперационном периоде, в условиях ОРИТ, всем больным проводилась антибактериальная терапия (с использованием карбапенемов, цефалоспоринов IV поколения, аминогликозидов II поколения, фторхинолонов), а также комплексная интенсивная терапия в необходимом объеме.

При проведении иммунологических исследований из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лейковзвесь, сыворотку, мононуклеарные клетки (МНК). МНК в концентрации 0,1 _ 106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в полной культуральной среде RPMI-1640 (Sigma, USA) при 37 °С в СО2-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонA, 15 мкг/мл, Sigma) и растворимые моноклональные анти-CD3 антитела (анти-CD3-мАТ ICO-90) ("Медбиоспектр", Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч после включения 3Н-тимидина (1 мкКи/лунку).

Методом проточной цитофлюориметрии (FACS Calibur, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела ("Сорбент-сервис", Москва), определяли содержание различных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+ и СD8+ Т-лимфоцитов, CD20+ В-лимфоцитов, CD16+ NK-клеток), а также относительное количество моноцитов, высокоэкспрессирующих HLA-DR антигены, и средний уровень экспрессии (mean fluorescence, MF) HLA-DR-молекул на моноцитах.

Методом проточной цитофлюориметрии среди свежевыделенных клеток лейковзвеси определяли также процентное содержание апоптотических лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов, которые вследствие фрагментации ДНК формируют характерный гиподиплоидный пик при окрашивании йодидом пропидия (50 мкг/мл) (Sigma, USA).

Наличие в сыворотке больных иммуносупрессорной активности оценивали по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК здоровых доноров (n = 2-3) при содержании 10 % интактной сыворотки больных (опыт - О) по сравнению с уровнем ответа при содержании 10 % интактной сыворотки доноров (контроль - К). При этом рассчитывали индекс супрессорной активности (ИСА) по следующей формуле: ИСА = О-К.

О суммарной активности эндогенных медиаторов воспаления в сыворотке больных судили по величине индекса воспалительной активности (ИВА). Сущность метода заключается в том, что в лейковзвеси здоровых доноров (n = 2-3), инкубированной в течение 45 мин с интактной сывороткой больных (опыт) или доноров (контроль) в объемном соотношении 1 : 1, определяют активность нейтрофилов по продукции перекиси водорода (Н2О2). ИВА высчитывают по формуле: ИВА = О-К.

Содержание в сыворотке крови 17 цитокинов (IL-1b, TNFa, IFNg, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, МСР-1, MIP-1b) оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 17-Plex (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя*. Метод основан на специфическом связывании исследуемых цитокинов с твердой фазой, которая представляет собой суспензию полистироловых гранул размером 5,5 мкм. Одновременно в анализе используется 17 типов гранул, каждый из которых различается собственной флюоресцентной меткой и конъюгирован с соответствующими моноклональными антицитокиновыми антителами. После специфического связывания гранул с цитокинами, содержащимися в исследуемых образцах сыворотки и в калибровочных пробах с известным их количеством, в реакционную смесь добавляют антицитокиновые антитела, конъюгированные с биотином. Для детекции образовавшейся "сэндвич-структуры" используют взаимодействие биотина со стрептавидином, меченным "репортерной" флюоресцентной меткой (фикоэритрином). Постановка всех реакций происходит в 96-луночном планшетном формате. Оценка результатов проводится на проточном флюориметре, где гранулы автоматически разделяются по типам с использованием их собственных FITC-меток, а количество связавшихся с ними цитокинов оценивается по суммарной интенсивности флюоресценции фикоэритрина. С помощью стандартных калибровочных разведений концентрация исследуемых 17 цитокинов в тестируемых образцах сыворотки высчитывается автоматически на персональном компьютере с использованием программы "Bio-Plex Manager".

Дополнительно оценивали сывороточный уровень рецепторного антагониста IL-1 (IL-1Ra) методом иммуноферментного анализа (тест-системы производства ООО "Цитокин", Санкт-Петербург, определяемый динамический диапазон 150-2500 пкг/мл). Кроме того, оценивали уровень общей фракции IL-10 (в свободной и связанной форме) с помощью иммуноферментных тест-систем "Accucyte Human IL-10" (Cytimmune Inc., USA, определяемый динамический диапазон 0,195-200 нг/мл).

Математическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ "STATISTICA 5,0". Таблицы содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (SE). Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона - Манна - Уитни. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирману.

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.