Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2004, № 1
|
Оригинальные статьи
|
Номер 1'2004
|
ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО IL-1B НА ЦИТОХРОМ Р450-ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗЫ ПЕЧЕНИ И ПОЧЕК. ВЗАИМОСВЯЗЬ СО СПЕЦИФИЧЕСКИМ И НЕЙРОЭНДОКРИННЫМ ЭФФЕКТАМИ
А.Т. Ахматов, С.В. Сибиряк, А.С. Симбирцев, Д.С. Сибиряк
В экспериментах на половозрелых неинбредных крысах-самцах человеческий рекомбинантный IL-1b (Беталейкин) (6,5 _ 105 ед/кг, однократно) наряду со стимуляцией гранулоцитопоэза снижал пролиферативную активность спленоцитов и тимоцитов, вызывал апоптоз тимоцитов и проявлял системное нейроэндокринное действие, индуцируя эмиссию глюкокортикостероидов, а также изменял конститутивную активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ в печени и почках. Влияние Беталейкина на различные изоформы цитохрома Р450 было неодинаково и характеризовалось тканеспецифичностью. Наряду с депрессией CYP1A1/2-зависимой этоксирезоруфин-деэтилазной, CYP2C-зависимой дибензилфлюоресцеин-дебензилазной, CYP2E1-зависимой p-нитрофенол-гидроксилазной активностей в печени и CYP1A1/2-зависимой этоксирезоруфин-деэтилазной активности в почках Беталейкин вызывал индукцию CYP3A-зависимого N-деметилирования эритромицина в этих органах. Это обусловлено нарастанием уровня кортикостероидов, 6b-гидроксилирование которых осуществляется кортикостероид-индуцибельными цитохромами подсемейства CYP3A. Данный механизм может лежать в основе саморегуляции уровня глюкокортикоидов в условиях индуцированного IL-1b стрессорного ответа. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 1. С. 32-38.)
Ключевые слова: интерлейкин 1, цитохром P450-зависимые монооксигеназы, Беталейкин, глюкокортикоиды.
В настоящее время твердо аргументировано, что цитокины (в первую очередь, провоспалительные цитокины) участвуют в сложной цепи нейроиммуноэндокринной регуляции гомеостаза и являются веществами с плейотропным действием на организм [5]. Среди системных эффектов цитокинов пристальный интерес вызывает их влияние на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы (ЦхР450). ЦхР450 являются суперсемейством монооксигеназ с различной субстратной специфичностью, задачей которых служит окислительная биотрансформация широкого круга поступающих в организм экзогенных химических соединений (в том числе лекарств), а также биотрансформация эндогенных липофильных соединений (стероидов, арахидонатов, жирорастворимых витаминов, желчных кислот и пр.).
В большинстве исследований в системе in vitro цитокины (IFNa, IFNb, IFNg, IL-1, TNFa, IL-6, IL-2 и др.) снижают уровень мРНК, белков различных изоформ ЦхР450 в гепатоцитах и соответствующие монооксигеназные активности [2, 3, 20, 21].
С продукцией IFNa, IFNb, IL-1, TNFa связано снижение содержания ЦхР450, угнетение монооксигеназных активностей и снижение фармакометаболизирующей функции печени при вирусных и бактериальных инфекциях, остром асептическом воспалении, введении бактериальных ЛПС [2, 8, 21]. Введение очищенных рекомбинантных цитокинов также оказывает депримирующее воздействие на ЦхР450, о чем свидетельствуют и экспериментальные, и клинические наблюдения [9, 12]. В то же время отмечено, что влияние цитокинов на различные изоформы ЦхР450 in vivo неоднозначно и характеризуется тканеспецифичностью: при острофазном ответе или введении рекомбинантных цитокинов возможна индукция некоторых изоформ цитохрома [7]. В настоящей работе проведена параллельная оценка специфической активности hrIL-1b (Беталейкина), его нейроэндокринного эффекта и влияния на монооксигеназные активности различных изоформ ЦхР450 в печени и почках.
Материалы и методы
Работа выполнена на неинбредных половозрелых крысах-самцах массой 140-160 г. Животные содержались в пластиковых клетках в стандартных условиях вивария с 12-часовым световым циклом "день - ночь", получали стандартное питание и свободный доступ к воде. При работе с животными соблюдались Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных. Все болезненные манипуляции и умерщвление животных осуществляли под эфирным наркозом, по достижении животными "бокового положения".
Рекомбинантный человеческий интерлейкин 1b (hrIL-1b, Беталейкин, Betaleukinum) (ГНЦ РФ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург) с удельной биологической активностью 108 ед/мг белка разводили стерильным изотоническим раствором хлорида натрия и вводили внутрибрюшинно. Объем вводимой жидкости составлял 1 мл на 100 г массы животного. Контрольные группы получали эквивалентное по объему количество физиологического раствора хлорида натрия, содержащего инактивированный нагреванием (90 °С, 1 ч) Беталейкин.
Для анализа гемограммы кровь (200 мкл) получали из ретроорбитального синуса. Эритроциты лизировали добавлением 2 мл CellLyse (Becton Dickinson, BD), дважды отмывали в 2 мл раствора CellWash (BD), ресуспендировали в 1 мл раствора CellFix (BD) и затем анализировали параметры прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния на проточном цитофлюориметре FACS Calibur (BD).
Для получения клеточных суспензий спленоцитов или тимоцитов кусочки органа помещали в 0,15M фосфатно-буферный физиологический раствор (ФСБР, pH 7,2), измельчали в стеклянном гомогенизаторе. Клеточную взвесь фильтровали через капроновый фильтр, эритроциты лизировали 0,83%-ным раствором NH4Cl, клетки отмывали, ресуспендировали в ФСБР, содержащем 10 % эмбриональной телячьей сыворотки.
Анализ клеточного цикла спленоцитов и тимоцитов осуществляли методом метахроматического окрашивания акридиновым оранжевым [10]. Клетки обрабатывали гипотоническим раствором (0,08M HCl; 0,15M NaCl; 0,1 % Triton X-100) в течение 15 с, затем окрашивали 20 мкМ раствором акридинового оранжевого (Сalbiochem) в 0,1 M фосфат-цитратном буфере (pH 6,0). Относительное содержание ДНК (FL2) и РНК (FL3) оценивали на проточном цитофлюориметре FACS Calibur (BD). При анализе регионов, соответствующих той или иной фазе клеточного цикла лимфоцитов ориентировались на рекомендации авторов метода [11].
Апоптоз тимоцитов оценивался также традиционным методом окрашивания йодистым пропидием (Sigma, USA), для чего клетки ресуспендировали в гипотоническом растворе йодистого пропидия (0,1 % цитрат натрия, 0,1 % Triton X-100, йодистый пропидий 50 мкг/мл), инкубировали 4-8 ч в темноте при 4 °С и подвергали проточной цитометрии, оценивая содержание гипохромных клеток.
Для оценки монооксигеназных активностей в печени и почках использовалась субмитохондриальная фракция (S12-фракция), для получения которой навеску органа гомогенизировали в тефлоновом гомогенизаторе (3000 oб/мин, 3 мин) в 50 mM TRIS-HCl буфере (pH 7,4), содержащем 1,15 % KCl. Далее гомогенат центрифугировали на центрифуге JUAN К23 с угловым ротором в режиме 12 000 g, 20 мин, при 4 °С. Супернатант (S12-фракцию) переносили в пластиковые пробирки (Costar) и хранили при -70 °С. Содержание белка в S12-фракции оценивали методом Брэдфорда, используя стандартный набор для определения белка ProteinAssay Kit (Bio-Rad).
Определение 7-этоксирезоруфин-О-деэтилазной (ЭРОД) активности осуществляли флюорометрическим методом [24]. Оценку дибензилфлюоресцеин-дебензилазной (ДБФД) активности проводили флюорометрическим методом [26], оценку р-нитрофенол-гидроксилазной (ПНФГ) и эритромицин-N-деметилазной (ЭРНД) активностей осуществляли колориметрически, используя при анализе ПНФГ активности метод [15], а при анализе ЭРНД активности метод [29]. При анализе монооксигеназных активностей использовали реактивы фирмы Sigma (USA) и дибензилфлюоресцеин фирмы GENTEST (BD).
Уровень кортикостерона в сыворотке оценивали флюорометрическим микрометодом [1].
Флюориметрические исследования проведены на флюориметре VersaFluor (Bio-Rad), колориметрические - на планшетном фотометре MultiskanPlus (Labsystems).
Статистическую обработку результатов исследования проводили стандартными методами вариационной статистики в рамках программного обеспечения Statistica for Windows, версия 5.5. Для отвержения "нулевой" гипотезы использовались, в зависимости от характера распределения, t-критерий Стъюдента для независимых признаков или непараметрические критерии различия. Различия между группами считались статистически значимы при p >= 0,05.
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!
Начата подписка на 2016 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
