Научно-практический журнал
[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'

197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru


  


2012 год
1 номер
3 номер

О Журнале

Архив

Рубрики
Подписка

NEW Книжная полка
NEW Стол заказов

Карта сайта
Правила для авторов

Поиск

Контакты
Наши партнеры:

https://pornoseksxxx.com/

Русский языкEnglish language
Карта сайта Написать письмо, наши координаты

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2004, № 2

Подписаться на 2012 год

Заказать эту статью в PDF

Оригинальные статьи

Номер 2'2004

РОЛЬ OMI/HTRA2 В КАСПАЗОНЕЗАВИСИМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА

Н.А. Маянский, Э. Блинк, Д. Роос, Т. Кайперс

Изучена роль митохондриальной сериновой протеазы Omi/HtrA2 в клеточной гибели нейтрофилов. В интактных клетках этот белок локализовался в межмембранном пространстве митохондрий, а при "классическом" апоптозе выделялся в цитозоль, где способствовал активации каспаз, причем специфический ингибитор сериновой протеазной активности Omi/HtrA2 - ucf-101 - не влиял на уровень спонтанного апоптоза нейтрофилов или апоптоза, вызванного воздействием только TNFa. При каспазонезависимой клеточной гибели нейтрофилов, индуцированной TNFa, протеаза Omi/HtrA2 оставалась в митохондриях, а добавление в культуру ucf-101 полностью предотвращало эту форму клеточной гибели. Приведенные результаты указывают на то, что интрамитохондриальная активность Omi/HtrA2 как сериновой протеазы требуется для каспазонезависимой гибели нейтрофилов. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 2. С. 47-51.)

Введение

Omi/HtrA2 является митохондриальной сериновой протеазой, участвующей в процессе клеточной гибели [4, 10, 12]. Omi/HtrA2 млекопитающих имеет значительную гомологию с бактериальной эндопротеазой HtrA (high temperature requirement A). Последняя локализуется в периплазматическом пространстве бактерий, и ее присутствие необходимо для поддержания термотолерантности: за счет сериновой протеазной активности HtrA удаляются поврежденные и денатурированные вследствие воздействия высокой температуры или оксидантного стресса белки [11]. Роль Omi/HtrA2 в гибели клеток была обнаружена недавно, когда выяснилось, что этот белок, в норме находящийся в межмебранном пространстве митохондрий, при апоптозе выходит в цитозоль (наряду с другими митохондриальными проапоптозными факторами) [4, 10]. Здесь Omi/HtrA2 связывается с белками - ингибиторами апоптоза (inhibitor of apoptosis proteins - IAPs) и инактивирует их, высвобождая секвестрированные IAPs каспазы, которые активируются и поддерживают дальнейшее развитие апоптоза (аналогично работает другой IAP-регуляторный белок, выделяемый митохондриями, - Smac/DIABLO) [12]. Предполагается, что эта функция не требует протеазной активности, хотя имеются данные о том, что IAPs могут быть прямыми субстратами Omi/HtrA2 (см. ниже). Активность Omi/HtrA2 как сериновой протеазы может быть востребована при каспазонезависимой гибели клеток, хотя субстраты-мишени в этом случае остаются неизвестными [4]. В настоящей работе на модели TNFa-индуцированной каспазонезависимой гибели нейтрофилов [2, 5, 6] демонстрируется важная роль протеазной активности Omi/HtrA2 для данного типа гибели клеток.

Материалы и методы

Нейтрофилы выделяли и культивировали согласно описанной ранее методике [1, 6, 7]. В 24-луночный планшет помещали 1 мл (5 _ 106 клеток/мл) взвеси нейтрофилов и инкубировали в присутствии TNFa (Calbiochem, Germany), zVAD-fmk (Alexis Biochemicals, USA), ucf-101 [3] (предоставлен A. Zervos, University of Central Florida, Orlando, USA), циклогексимида (Calbiochem) в указанных в тексте комбинациях и концентрациях (см. также подписи к рисункам).

Оценку клеточной гибели проводили путем проточной цитометрии нейтрофилов, меченных аннексином-V-ФИТЦ и йодидом пропидия (ИП; Bender Medsystems, Austria), а также при помощи окрашивания митохондрий флуоресцентным красителем MitoTracker GreenFM (Molecular Probes, USA) с последующим подсчетом процента клеток с агрегированными митохондриями (см. рис. 2, б) [1, 6, 7].

Субклеточное фракционирование и иммуноблоттинг (Western blotting, WB) проводили следующим образом [7, 8]. Нейтрофилы отмывали в ледяном PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и взвешивали в ледяном буфере для экстракции цитозоля [состав: 250 мМ сахарозы, 70 мМ KCl, 250 мкг/мл дигитонина, 1 таблетка Complete Mini protease inhibitor cocktail (Roche, Germany); 2 mM диизопропилфторофосфата (DFP; Acros Organics, USA), 5 мМ ЭДТА в 5 мл PBS] в конечной концентрации 100 _ 106 клеток/мл. После 10-15 мин инкубации на льду, когда 80-90 % клеток становились проницаемыми для трипанового синего, суспензии осаждали центрифугированием (1000 _ g, 5 мин) и собирали надосадок как цитозольные фракции. Остававшийся в пробирках осадок ресуспендировали в ледяном митохондриальном лизис-буфере (состав: 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 Ч 6H2O, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА, 1 % детергента NP-40, 10 % глицерина, 1 таблетка коктейля ингибиторов протеаз, 2 мМ DFP в 5 мл 50 мМ Tris-буфера, рН 7,5) в объеме, равном объему буфера, использованного для экстракции цитозоля. После 10-минутной инкубации на льду проводили центрифугирование (10 000 _ g, 10 мин) и полученный надосадок собирали как митохондриальные фракции.

Для приготовления образцов для WB 24 мкл цитозольной/митохондриальной фракции смешивали с 8 мкл четырехкратного загрузочного буфера, содержащего додецилсульфат натрия (sodium dedecyl sulfate sample buffer, SDS-SB; состав 4 _ SDS-SB: 5 % SDS, 40 % глицерина, ~0,01 % красителя Comassie blue в 125 мМ Tris-буфере, рН 6,8) и 8 % b-меркаптоэтанола, и кипятили в течение 5 мин, после чего полученные образцы использовали для электрофореза. Электрофорез белков проводили в 12,5%-ом полиакриламидном геле, содержащем SDS (SDS-PAGE). Для WB использовали поликлональные антитела против Apaf-1 (Pharmingen, USA) и MnСОД (Stressgen, Canada) в разведении 1 : 1000. Анти-Omi/HtrA2 поликлональные антитела [4] были предоставлены проф. E.S. Alnemri (Thomas Jefferson University, Philadelphia, USA) и использовались в разведении 1 : 5000.

Внутриклеточную локализацию ucf-101 определяли с помощью конфокального микроскопа (LSM510, Carl Zeiss, Germany). Нефиксированные нейтрофилы инкубировали с 20 мкМ ucf-101 и 100 нМ MitoTracker GreenFM в течение 15 мин при 37 °С, отмывали и микроскопировали согласно [7]. Анализ изображения проводили с использованием пакета программ LSM510 Image software (Carl Zeiss).

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2012 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.

© 2002-2012 Цитокины и Воспаление