Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2005, № 1
|
Оригинальные статьи
|
Номер 1'2005
|
ПОЛИМОРФИЗМ КЛАСТЕРА ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА 1 У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
М.М. Имангулова, А.Р. Бикмаева, Э.К. Хуснутдинова
Изучено распределение генотипов и аллелей полиморфных генов семейства IL1 (IL1B и ILRA) у 158 пациентов с инфильтративным туберкулезом легких (ИТЛ) и 180 здоровых индивидов Башкортостана. Анализ VNTR-полиморфизма гена ILRA выявил достоверные различия в распределении частот генотипов и аллелей между больными ИТЛ и контрольной группой (p < 0,0001). Частота генотипа *1/*1 у больных ИТЛ составила 82,9 % по сравнению с 61,6 % у здоровых индивидов (OR = 3,022, 95% CI 1,76-5,20). При анализе +3954C/T гена IL1B различий между исследуемыми группами не обнаружено (c2 = 1,28, р = 0,564). Распределение частот генотипов -511C/T гена IL1B показало, что частота генотипа IL1B*А2А2 у больных ИТЛ повышена почти в 2 раза (33,96 %) по сравнению с контролем (17,92 %) (р = 0,0002, OR = 2,76, 95 %CI 1,48-5,20). Проанализированы комбинации генотипов генов IL1B и ILRA. Среди больных достоверно чаще встречались носители гаплогрупп А, В и D (OR = 4,17, 95 %CI 1,13-18,17; OR = 12,89, 95%CI 0,99-6932,3; OR = 16,29, 95%CI 2,28-333,0), которые можно рассматривать как факторы повышенного риска развития ИТЛ. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 36-41.)
В настоящее время не вызывает сомнения то, что генетические факторы в значительной мере определяют восприимчивость организма к различным заболеваниям, в том числе и инфекционной природы. Так, подавляющее большинство инфицированных M. tuberculosis остаются вполне здоровыми благодаря имеющемуся у них протективному иммунитету, и только у 5-10 % людей иммунный ответ оказывается неэффективным, в результате чего происходит реактивация латентно протекающей инфекции и развитие активных форм туберкулеза [14].
Контроль за M. tuberculosis осуществляется широким спектром иммунокомпетентных клеток и продуцируемых ими цитокинов. На данный момент накопилось достаточно фактов, свидетельствующих о том, что патологические отклонения иммунного ответа связаны с нарушениями в продукции цитокинов. Среди цитокинов, играющих важную роль в координации иммунологических реакций, значительное место отводится IL-1, являющемуся главным медиатором LPS-индуцированного воспаления в легких [4].
У больных легочным туберкулезом в мокроте и бронхоальвеолярном лаваже отмечена высокая концентрация IL-1, что подтверждает участие этого цитокина как в местном, так и в системном воспалении при туберкулезе легких [10].
Семейство IL-1 включает два агониста - IL-1a и IL-1b и их специфический антагонист IL-1Ra. IL-1a и IL-1b кодируются разными генами, но имеют гомологию в аминокислотной последовательности 26 % и обладают практически одинаковой биологической активностью [11]. IL-1 является индуцибельным белком, синтез которого начинается в ответ на внедрение микроорганизмов, таких как микобактерии, либо повреждение тканей и необходим для развития воспаления и осуществления всего комплекса защитных реакций, именуемых острофазовым ответом [3]. Важнейшие свойства IL-1 - стимуляция пролиферации преактивированных антигеном зрелых Т-лимфоцитов, увеличение продукции IL-2, IL-4, INFg и TNFa, а также стимуляция фагоцитоза.
Основными клетками-продуцентами и главным источником IL-1 в организме являются моноциты и макрофаги, а также Т- и В-лимфоциты, NK-клетки, клетки эндотелия и нейтрофилы. У человека IL-1b является главной формой секреторного IL-1, а IL-1a находится преимущественно в виде мембранной формы [4].
IL-Ra был впервые выделен из культуральной среды стимулированных моноцитов и обладал способностью ингибировать действие IL-1 на лимфоциты и фибробласты путем блокирования связывания IL-1 с клеточными рецепторами. Результаты структурного анализа молекулы IL-1Ra, проведенные после клонирования гена и получения рекомбинантного белка, показали, что IL-1Ra имел такую же, как и IL-1 молекулярную массу, а аминокислотная последовательность была на 26 % гомологична IL-1b и на 19 % - IL-1a [11]. Поэтому IL-1Ra может считаться одним из белков семейства IL-1. Изменения в его строении по сравнению с молекулами IL-1a и IL-1b привели к утрате способности к проведению сигнала, но сохранили возможность высокоаффинного связывания с рецепторами. Именно это свойство и обуславливает уникальную для биологии цитокинов ситуацию - существование IL-Ra как естественного специфического ингибитора IL-1.
Гены, кодирующие IL-1b и IL-1Rа, картированы на длинном плече хромосомы 2 в области q14. Известно два биаллельных полиморфизма в гене IL1B: в промоторной части в положении -511 (С-511Т) [6] и в 5-м экзоне (С3954Т) [7, 9], где аллели -511Т и +3954Т ассоциированы с более высокой продукцией цитокина.
В гене ILRA известен минисателлитный полиморфизм - вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов (VNTR) во 2-м интроне, который предполагает существование пяти аллелей, каждому из которых соответствует определенное число повторов [9]. Наиболее часто встречаются аллель ILRA*1, содержащий 4 повтора (у 74 % населения), и аллель ILRA*2, содержащий 2 86-членных повтора (21 %). Оставшиеся же аллели встречаются менее чем в 5 % случаев. Вопрос о функциональной значимости данного полиморфизма остается открытым. Предполагается, что увеличение числа повторов ведет к повышению транскрипционной активности ILRA. Однако большинство исследований показало, что макрофаги, стимулированные гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) in vitro, продуцируют избыточное количество рецепторного антагониста IL-1Rа и сниженное количество IL-1b, если являются носителями аллеля ILRA*2 [14]. Hurme et al. продемонстрировали, что аллель 2 ILRA также способствует повышению концентрации антагониста IL-1Rа в плазме, но только в комбинации с аллелем -511Т гена IL1B [14]. В другом исследовании обнаружено, что моноциты - "носители" аллеля ILRA*2 способствуют увеличению продукции IL-1b in vitro, независимо от характера полиморфизма в гене IL1B [13]. Таким образом, разнообразные исследования противоречат друг другу. В некоторых работах продемонстрировано, что ILRA*2 ассоциирован с повышенным [13, 14], пониженным [15] и сходным [15] уровнем секреторного IL-1Rа по сравнению с другими аллелями.
Хорошо известно, что почти 50 % европейской популяции являются носителями аллеля ILRA*2 гена ILRA [5]. Широкая распространенность данного аллеля среди популяций позволяет гетерозиготам *1/*2 быть наиболее устойчивыми к туберкулезу легких. Гомозиготы *2/*2, согласно Santtila S et al. [13], намного чаще подвергаются различным инфекционным и воспалительным заболеваниям.
Цель настоящего исследования - изучение распределения генотипов и аллелей генов IL1B и ILRA у больных инфильтративным туберкулезом легких (ИТЛ), а также анализ возможных ассоциаций генотипов этих генов с риском развития туберкулеза.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили образцы ДНК больных инфильтративным туберкулезом легких (158 человек различной этнической принадлежности - русские, татары и башкиры), находящихся на стационарном лечении в Городском туберкулезном диспансере г. Уфы. Диагноз ИТЛ ставился на основании данных клинико-лабораторного исследования и рентгенографии. В качестве контроля использовали ДНК 180 здоровых, не находящихся в родстве, жителей Республики Башкортостан, никогда не болевших туберкулезом и не состоящих на учете в диспансере, а также соответствующих по возрасту и этнической принадлежности.
ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции по стандартной методике [2].
Анализ полиморфных локусов генов ILRA и IL1B проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в стандартных условиях на амплификаторе "Терцик". Варианты С-511Т, С3953Т гена IL1B и VNTR гена ILRA выявляли с использованием праймеров, описанных в работе [14]. ПЦР вариантов С-511Т и С3953Т проводили в следующем режиме: первый цикл: 94 °С, 4 мин, далее 28 циклов 94 °С - 56 °С - 72 °С по 45 сек; после окончания амплификации смесь инкубировали 5 мин при 72 °С. Полученные амплифицированные фрагменты обрабатывали рестриктазами AvaI(С-511Т) и TaqI(С3953Т) (ООО "Сибэнзим", Новосибирск). Длина продуктов расщепления для TaqI(С3953Т) составляла: при наличии сайта рестрикции (аллель С) - 135 и 114 пн, при отсутствии (аллель Т) - 249 пн. Для варианта С-511Т (AvaI) при наличии сайта (аллель А1) - 190 и 114 пн, при отсутствии (аллель А2) - 304 пн.
Амплификацию фрагментов VNTR-варианта гена ILRA проводили при следующих температурных условиях: 4 мин - денатурация при 95 °С, затем проводили 27 циклов амплификации в режиме: 94 °С - 40 сек, 60 °С - 40 сек, 72 °С - 1 мин, после чего смесь инкубировали 5 мин при 72 °С. Распределение аллелей данного полиморфного минисателлита следующее: аллель 1 - 410 пн, 2 - 240 пн, 3 - 500 пн, 4 - 325 пн, 5 - 595 пн. Нами учитывались только первые два аллеля, в связи с редкой встречаемостью 3, 4 и 5 аллелей.
Продукты амплификации и рестрикции анализировали в 7%-ном полиакриламидном геле в 1 x TBE буфере. ДНК фрагменты идентифицировали в проходящем УФ-свете, после окрашивания бромистым этидием.
Соответствие наблюдаемых распределений частот генотипов теоретически ожидаемым по закону Харди-Вайнберга оценивали по критерию c2 с помощью программы RхC (RowsхColumns) [12].
Попарное сравнение частот аллелей и генотипов проводили с использованием точного двустороннего теста Фишера [1] в рамках программы Statistica для Windows, версия 5.0. Статистически значимыми считали различия при р " 0,05.
Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов (odds ratio, OR) по формуле:
OR = (ad)/(bc),
где a и b - число лиц с наличием/отсутствием данного генотипа, соответственно, а c и d - число здоровых лиц с наличием/отсутствием данного генотипа [1].
Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2005 и 2006 годы!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!
Начата подписка на 2013 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
