Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2005, № 1
|
Оригинальные статьи
|
Номер 1'2005
|
ПРОТЕКТИВНАЯ РОЛЬ ЦЕРЕБРОЛИЗИН-ИНДУЦИРОВАННОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТАЛЛОТИОНЕИНА-I И МЕТАЛЛОТИОНЕИНА-II ПРИ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ОЧАГОВОЙ ИШЕМИИ У КРЫС
О.А. Громова, Н.Ю. Сотникова,2, С.И. Катаев, А.Н. Галустян, Л.М. Красных, С.В. Мазина
Церебролизин (FPF-1070) известен как препарат, обладающий нейропротективными, антиоксидантными и нейротрофическими свойствами. Многочисленные фармакодинамические эффекты Церебролизина обусловлены присутствием в препарате низкомолекулярной фракции пептидов и L-аминокислот. Клиническая эффективность Церебролизина при ишемии мозга была продемонстрирована в нескольких исследованиях, однако точные молекулярные механизмы, отвечающие за нейропротективный эффект препарата остаются слабо изученными. Металлотионеины (МТ) представляют собой низкомолекулярные цистеин-содержащие белки, участвующие в развитии антиоксидантного ответа и связывании ионов металлов. Целью данного исследования было обнаружение способности FPF-1070 стимулировать продукцию МТ-1 в коре головного мозга крыс при экспериментальной транзиторной очаговой ишемии. Транзиторная очаговая ишемия вызывалась 30-минутной окклюзией общей сонной и правой средней мозговой артерий. Экспериментальной группе крыс вводился FPF-1070 в дозе 10 мкг/г веса внутривенно за 1 час до начала окклюзии артерий. В коре головного мозга крыс, подвергавшихся ишемии, уровень мРНК МТ-1, определявшихся с помощью количественной полимеразной цепной реакции увеличился в 8, а МТ-2 - в 7,8 раз. При введении FPF-1070 уровень МТ-1 возрастал в 16,2 раз, МТ-2 - в 16,5 раза. Данные результаты свидетельствуют о том, что нейропротективый механизм действия Церебролизина при ишемии мозга обусловлен повышенной продукцией нескольких белков, включая MT-1. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 42-46.)
Токсичные металлы и гены, которые они индуцируют, ассоциируются с клеточной гибелью и окислительным стрессом. Биологические системы выработали различные защитные пути. Одним из вариантов такой защиты являются металлотионеины (МТ), способные утилизировать и аккумулировать тяжелые металлы [20]. МТ - это богатые цистеином низкомолекулярные протеины с плейотропными функциями [20]. В настоящий момент у человека известно 4 класса МТ, насчитывающие 16 изоформ [20]. МТ имеют молекулярную массу до 6-7 кДа и способны связывать широкий спектр металлов, в том числе и токсичных (Pb, Cd) [14]. Металлы индуцируют экспрессию этих белков в различных тканях (мозг, печень, миокард и т.д.). Помимо металлов, МТ индуцируются стероидами у крыс [15], канцерогенами у мышей [6], химическими веществами, вызывающими окислительный стресс у грызунов [11], ионизирующей радиацией [8] и УФО [18]. Индукция МТ-1 не происходит в присутствии ЭДТА, при отсутствии в культуральной среде цинка или при нарушении транспорта цинка внутрь клетки. В экспериментах на животных было показано, что МТ индуцируются провоспалительными цитокинами [5]. Индукция МТ-1 мРНК не зависит от белкового синтеза и коррелирует с окислительно-восстановительными функциями антиоксидантов. Исследования последних лет показали, что МТ могут играть важную роль в антиоксидантной защите [6]. Большое число исследований свидетельствует о прямом участии МТ в защите различных тканей от повреждающего действия металлов и окислительного стресса [19]. Феноловые антиоксиданты активируют транскрипцию МТ-1 за счет цинк-зависимого механизма, в котором основным является связывание MTF-1 (активируемого металлами транскрипционного фактора) с металлорегулируемыми структурами промотора гена МТ-1 [7]. Если МТ не индуцируются, защита тканей и, в частности, мозга от тяжелых металлов значительно нарушается, и возрастает чувствительность тканей к действию окислительно-стрессовых факторов [16]. Считается, что они играют важную роль и в туморогенезе [21]. Экспрессия мРНК МТ в клетках трофобласта человека защищает последние от индуцированного кадмием апоптоза за счет увеличения времени поступления Са2+ внутрь клетки [17]. Показано также, что экспрессия МТ ассоциируется с более благоприятным вариантом функционирования трансплантатов сердца. При этом существует прямая корреляционная связь между уровнем IL-6 и обратная - с уровнем IL-2 и экспрессией МТ [5]. К сожалению, исследования, посвященные микроэлементному составу мозга и МТ в мозге, единичны. Получены данные, свидетельствующие о том, что у человека ионизирующая радиация индуцирует в ЦНС как протеин МТ, так и экспрессию мРНК МТ-2. Однако индукция синтеза МТ цинком защищает мозг от повреждающего действия радиации [8].
Целью данного исследования было изучить влияние FPF-1070 на продукцию МТ-1 и МТ-2 в коре головного мозга крыс на модели транзиторной очаговой ишемии.
Материалы и методы
Исследование проводили на 60 белых крысах со средним весом 189+3,2 г. Возраст животных на время эксперимента составил 3-5 мес. Все животные содержались на стандартной диете, со свободным доступом к воде, в изолированных клетках и не использовались в течение всей жизни ни в каких других экспериментальных работах. Было выделено 3 группы животных. 20 интактных крыс служили в качестве группы контроля (1-я группа). У 20 животных опытной группы (2-я группа) вызывали транзиторную очаговую ишемию путем создания 30-минутной окклюзии общей сонной и правой средней мозговой артерий. 20 крысам 3-й группы за 1 час до начала окклюзии артерий вводили Церебролизин в дозе 10 мкг/г веса внутривенно.
По окончании исследования животные были умерщвлены под гексеналовым наркозом, и головной мозг был извлечен из полости черепа по стандартной методике. Последняя операция заключалась в рассечении браншами ножниц костей черепа по границе между ее основанием и сводом. После отделения свода черепа вместе с твердой мозговой оболочкой перерезали черепные нервы. Мозг извлекали и помещали в чашку Петри, после чего производили срезы кусочков ткани коры мозга толщиной 1-1,5 мм весом до 500 мг в зоне, кровоснабжающейся из бассейна правой средней мозговой артерии, по стандартной методике [3]. Полученные образцы сразу же подвергали замораживанию в жидком азоте и сохраняли в маркированных пакетах до момента проведения RT-PCR исследования.
Общую РНК, обогащенную мРНК, выделяли из ткани коры крыс одноэтапным методом [9] с помощью готовых для использования реагентов (RNA STAT-60, Tel Test B, Friendswood TX, USA), включавших фенол и тиоцианат гуанидина в монофазном растворе. Ткань коры головного мозга крыс (200 мг) гомогенизировали в денатурирующем растворе (2 мл) в стеклянно-тефлоновом тканевом гомогенизаторе. Гомогенат смешивали с ацетатом натрия (2 M; 0,2 мл), насыщенным водой фенолом (2 мл) и смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (49:1; 0,4 мл). После инкубации в течение 15 минут при температуре 4 °C и центрифугирования при 9500 об./мин в течение 20 мин при 4 °C общую РНК осаждали 100%-ным изопропанолом при -20 °C. РНК ресуспендировали в DEPC-обработанной воде и хранили при -70 °C до анализа. Для удаления остаточной геномной ДНК изолят обрабатывали свободной от РНКазы ДНКазой RQ1 (Promega, Madison, WI, USA). Качество выделенной РНК оценивали по наличию рибосомальной 18S РНК.
Обратную транскрипцию для получения кДНК проводили стандартным методом [10] в конечном растворе, содержащем 0,2 мМ каждого d-нуклеотидтрифосфата, 10 мкМ праймеров в буфере и Taq ДНК-полимеразу (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Для обратной транскрипции использовали общую РНК (2 мкг). Конечную кДНК, 2 мл которой эквивалентно 0,2 мкг общей РНК, амплифицировали.
Методику RT-PCR в реальном масштабе времени проводили по описанной ранее методике [10] с помощью термосайклера GeneAmp 5700 (Applied Biosystems, USA), в соответствии с инструкциями производителя (один цикл при 50 °С - 2 мин, один цикл при 95 °С - 10 мин, 40 циклов при 95 °С - 15 сек. и 60 °С - 1 мин). Каждый образец содержал 12,5 мкл готового 2 x Master mix, 1,5 мкл соответственно разведенного флюоресцентного красителя Syber green и пару праймеров МТ1-МТ2 в конечной концентрации 0,8 мкМ для каждого праймера и 1 мкл кДНК. ПЦР проводили в трех повторах в 96-луночных планшетах. Каждый планшет имел отрицательный и положительный контроль. В качестве внутреннего контроля использовали GAPDH, по отношению к которому нормализовали транскрипты МТ-1 и МТ-2. Пороговую флюоресценцию во всех случаях определяли, исходя из средней флюоресценции от всех образцов для циклов 3-15 [10]. Последовательности праймеров представлены в табл. 1. В качестве негативного контроля при каждой амплификации использовали образцы, не содержащие кДНК или праймеры. В качестве внутреннего контроля использовали GAPDH. Нормализацию данных проводили по отношению к уровню экспрессии РНК у интактных крыс.
Препаратом выбора для исследования был Церебролизин. Он (FPF-1070) используется в качестве препарата с нейропротективным, антиоксидантным и нейротрофическим эффектами. Фармакодинамические эффекты Церебролизина в мозге обусловлены присутствием низкомолекулярной фракции нейропептидов и L-аминокислот. Совокупность терапевтических эффектов Церебролизина определяется мембраностабилизирующим, ростостимулирующим и метаболическим влиянием препарата. В последние годы появились данные о роли Церебролизина в стабилизации металлолигандного гомеостаза в мозге [1, 2]. Некоторые нейропептиды, в частности, фактор роста нервов (NGF), и аминокислоты способны формировать компактные комплексы с цинком, которые облегчают трансмембранный транспорт и усиливают аффинитет взаимодействия лиганда с рецепторными молекулами. Цинк является компонентом более 1000 внутриклеточных белков и ферментов и играет значительную роль в предупреждении нейродегенеративных процессов и апоптоза нейронов [2].
Статистическую обработку материала проводили с помощью программы Statistica.
Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2005 и 2006 годы!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!
Начата подписка на 2013 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
