197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2005, № 1

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ IL1B(+3953) И TNFA(-308) В ПАТОГЕНЕЗЕ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

О.А. Герцог, С.В. Сенников, Л.П. Коненкова, Е.В. Зонова, М.А. Королев, А.Э. Сизиков, В.А. Козлов

Ведущая роль в патогенезе ревматоидного артрита (РА) принадлежит провоспалительным цитокинам IL-1b и TNFa. Целью исследования было изучение характера распределения генотипов IL1B(+3953) и TNFA(-308) среди здоровых и больных РА жителей России европеоидного происхождения, а также оценка степени ассоциированности данных генотипов с уровнем продукции соответствующих цитокинов, параметрами состояния иммунной системы и уровнем ряда сывороточных цитокинов, а также показателями клинической активности и наличием анемии у больных РА до лечения. Генотипировано 150 больных РА и 104 здоровых донора. Клиническое обследование, оценка параметров иммунного статуса, уровня сывороточных цитокинов и уровня продукции цитокинов клетками периферической крови проведены у 30 больных до назначения патогенетической терапии. Выявлено, что картина распределения генотипов изучаемых генов, в целом, совпадает с кавказоидами других стран и отличается от распределения в монголоидных популяциях. Выявлена положительная ассоциация генотипа А/G в промоторном участке гена TNFA в точке -308 с развитием РА (p = 0,02). У больных РА до назначения патогенетической терапии генотип A/G (TNFA -308) ассоциируется с повышенным содержанием клеток с фенотипом CD16+ (p = 0,02) и отсутствием в системном кровотоке цитокинов IL-2 и IL-7 (p < 0,05). Наличие аллеля Т (IL1B +3953) ассоциируется с низким содержанием пролактина в сыворотке крови (р = 0,03) и редким развитием анемии (р = 0,03). Таким образом, изучаемые полиморфные варианты генов цитокинов влияют на развитие РА и ряд иммунологических и клинических параметров при этом заболевании. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 52-57.)

Ревматоидный артрит - хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани с поражением преимущественно периферических суставов по типу прогрессирующего симметричного эрозивно-деструктивного полиартрита, а также характерными внесуставными проявлениями. Вопрос этиологии заболевания до сих пор остается открытым. Достаточно убедительно показано, что риск заболеть РА возрастает многократно у кровных родственников. Продвижением в понимании механизмов генетической предрасположенности явилось установление ассоциации между развитием РА и аллелями второго класса главного комплекса гистосовместимости (HLA-DRB1), но это объясняет только часть общего генетического риска, т.к. развитие заболевания возможно и без наличия данных аллелей. Известно, что ведущая роль в патогенезе этого заболевания принадлежит провоспалительным цитокинам - IL-1b и TNFa, которые потенцируют каскад воспалительных реакций локально и поддерживают многие системные проявления ревматоидного артрита. Это подтверждается высокой эффективностью применения антицитокиновых препаратов из группы биологических агентов: Инфликсимаба - химерных моноклональных антител к TNFa и Анакинры - антагониста рецептора IL-1. Учитывая, что гены IL1B и TNFA являются полиморфными, и, по данным литературы, тот или иной аллельный вариант гена цитокина влияет на уровень его продукции, можно предположить, что наследование аллельных вариантов этих генов, ассоциированных с высокой продукцией цитокинов, будет способствовать развитию РА, влиять на характер его течения и чувствительность к терапии. В исследовании представленных в данной статье аллельных вариантов двух генов: IL1B(+3953) в 5-м экзоне и TNFA(-308) у больных РА в популяциях разных стран получены противоречивые данные, которые свидетельствуют, что, как правило, пациенты, имеющие генотип -308G/A гена TNFA, имеют более тяжелое течение РА, чем несущие G/G генотип. У пациентов с аллелем G/A отмечалось более раннее начало заболевания, более высокая активность, большее число эрозий [4]. В то же время, в других популяциях больных рассматриваемый аллельный вариант гена TNFA не влиял на тяжесть и течение РА и не был ассоциирован с этим заболеванием [8]. При исследовании полиморфизма гена IL1B в точке (+3953 RТ) 5-го экзона было выявлено, что генотип Т/T (А2А2 аллель) ассоциирован с более активным РА по сравнению с генотипами C/C и C/T [4]. Из других данных известно, что наличие аллеля Т в этой точке ассоциировано с большим числом эрозий при РА и высокой экспрессией гена in vitro [3]. Учитывая противоречивость имеющихся данных, а также то, что закономерности распределения аллей генов отличаются в разных популяциях, а влияние на течение и развитие болезни связано, скорее, с комплексом наследуемых генотипов, целью нашего исследования явилось изучить характер распределения аллельных вариантов IL1B (+3953) в 5-м экзоне и TNFA(-308) среди здоровых и больных РА жителей России европеоидного происхождения. А также оценить степень ассоциированности данных генотипов с уровнем продукции соответствующих цитокинов, параметрами состояния иммунной системы и уровнем ряда сывороточных цитокинов; показателями клинической активности и наличием анемии у больных РА до лечения.

Материалы и методы

В исследование были включены 150 больных РА, госпитализированных в клинике ИКИ г. Новосибирска, среди которых было 22 мужчины и 128 женщин, в возрасте от 17 до 74 лет. Диагноз РА верифицирован в соответствии с критериями AKR 1987 г.

Контрольную группу составили 104 здоровых человека в возрасте от 21 до 55 лет.

Клиническое обследование, определение уровня сывороточных цитокинов, показателей иммунного статуса и уровня продукции цитокинов проведено у 30 больных РА до назначения базисной противовоспалительной терапии и других видов терапии, влияющих на продукцию цитокинов.

Клиническое обследование включало определение показателей активности заболевания, уровня гемоглобина (наличие анемии), степени выраженности остеопороза (показатель минеральной плотности костной ткани), определение уровня пролактина, оценка показателей системы гемостаза, возраст начала заболевания.

Методом проточной цитофлюориметрии (FACS Calibur, Becton Diskinson, США), используя соответствующие моноклональные антитела, определяли содержание различных субпопуляций лимфоцитов, относительное количество моноцитов, высокоэкспрессирующих антигены HLA-DR, средний уровень экспрессии молекул HLA-DR на моноцитах. Также проводилась оценка фагоцитарной активности моноцитов и гранулоцитов периферической крови по FcR-зависимому фагоцитозу иммунных комплексов, функциональная оценка эффекторов ГЗТ. Показатели активности моноцитов и макрофагов оценивали по стимуляции продукции перекиси водорода с помощью планшетного ридера Multiscan MS (Финляндия).

Уровень сывороточных цитокинов исследовали методом проточной иммунофлюоресценции на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем 17-Plex. В исследование входило определение уровня 17 цитокинов: IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MCP-1, MIP-1b, TNFa, IFNg. Нижняя граница чувствительности метода составляла 2 пг/мл.

Для получения кондиционной среды мононуклеары крови (1 x 10⁶/мл) культивировали 48 ч в полной среде RPMI-1640, дополненной 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл гентамицина и 10 % FCS при 37 оC во влажной атмосфере с 5 % СО2.

Уровень продукции цитокинов определяли электрохемилюминесцентным методом с использованием анализатора ORIGEN, разработанного фирмой "IGEN Inc." (США). Подготовку реактивов и определение каждого цитокина проводили описанным ранее способом [11].

Исследованы варианты IL1B(+3953) в 5-м экзоне CRT и TNFA(-308) в промоторном участке GRА.

Для генотипирования здоровых и больных РА использовали образцы ДНК, выделенной из цельной венозной крови с помощью силики. Генотипирование осуществляли путем рестрикционного анализа продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием праймеров опубликованной структуры и соответствующих ферментов рестрикции (табл. 1). После проведения ПЦР продукты амплификации подвергали рестрикции соответствующими эндонуклеазами (см. табл. 1): рестрикционная смесь включала 10 мкл амплификата и 2 единицы активности фермента фирмы "Сибэнзим" (Новосибирск). Рестрикцию продукта амплификации гена IL1B проводили в течение 1 ч при 65 оС, TNFA - в течение 1 ч при 37 оС. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI ("Сибэнзим", Новосибирск).

В работе использовали стандартные алгоритмы биометрии, включая анализ таблиц сопряженности (c2), критерий отношения шансов OR с расчетом для него 95%-ного доверительного интервала (CI). Сравнение средних значений проводили непараметрическим методом Манна-Уитни. Расчеты проводили с помощью программ "Statistica for Windows 5.0" и "EPI-6".

Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2005 и 2006 годы!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2013 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.