Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2005, № 2
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА УРОВНЯ 17 ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ И ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ФЛЮОРИМЕТРИИ
А.А. Останин, Е.Р. Черных
Целью исследования было определение нормативных значений цитокинового статуса на основе сравнительной оценки содержания 17 цитокинов (IL-1b, TNFa, IFNg, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, МСР-1, MIP-1b) в сыворотке и цельной крови здоровых доноров как на уровне спонтанной продукции, так и при митогенной стимуляции бактериальным эндотоксином и конканавалином А. Выявлена индивидуальная вариабельность сывороточного уровня IFNg, IL-13, IL-1b, TNFa, MIP-1b, G-CSF и GM-CSF, а также достоверная обратная корреляционная взаимосвязь между возрастом обследованных доноров и содержанием в сыворотке IFNg, TNFa, IL-12, IL-7 и GM-CSF. При сравнительном анализе доноров до 30 лет (в среднем 24 года) и старше 43 лет (в среднем 48 лет) установлено, что лица старшей возрастной группы характеризуются более низким сывороточным уровнем провоспалительных (IL-1b, TNFa), Th1- (IFNg), Th2-цитокинов (IL-13) и факторов иммуногемопоэза (IL-7, GM-CSF). Показано, что исследования спонтанной и индуцированной продукции цитокинов в 24-часовых супернатантах цельной крови повышают информативность оценки цитокинового статуса человека. Полученные значения уровней цитокинов in vivo и ex vivo, детально представленные в виде М + S.E., median и диапазона min-max, могут использоваться в качестве нормативной базы в дальнейших исследованиях. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 25-32.)
Для заинтересованного читателя, который обращается к такому специализированному журналу, как "Цитокины и воспаление", наверное, нет необходимости подробно объяснять во введении важность и актуальность изучения роли цитокинов в регуляции иммунного ответа, гемопоэза, воспаления и т. д. и тем самым превращать данный раздел статьи в "ритуальную молитву". О неослабевающем интересе к системе цитокинов свидетельствуют тысячи оригинальных и обзорных работ, ежегодно публикуемых в современной научной периодике. Бесспорно, что за последние 10-20 лет наши представления о структуре и организации цитокиновой сети, об особенностях функционирования ее регуляторных подсистем в норме и при различных иммунопатологических состояниях значительно расширились [3, 7]. Однако нельзя не отметить одну очень важную проблему. Парадоксально, но, несмотря на то, что количество детально охарактеризованных цитокинов постоянно растет, значения физиологической нормы для многих из них до сих пор не установлены. Поэтому иногда очень трудно, а иногда и невозможно корректно оценить особенности цитокинового профиля в том или ином конкретном клиническом случае, хотя и считается, что оценка уровня цитокинов в различных биологических материалах (сыворотке, цельной крови, культуральных супернатантах и т.д.) должна занять центральное место среди современных методов иммунодиагностики [1, 10].
С появлением в арсенале иммунологических лабораторий автоматизированного анализатора нового поколения (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA), который проводит одномоментное количественное определение до 100 различных белков и пептидов в тестируемом образце, появилась надежда на улучшение существующего положения. В частности, в настоящее время разработаны коммерческие тест-системы для определения 17 цитокинов человека (IL-1b, TNFa, IFNg, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, МСР-1, MIP-1b). Поскольку ряд цитокинов из предложенной панели ранее был недоступен для лабораторного тестирования, представлялось важным при проведении дальнейших исследований сначала определить их нормативные значения. Поэтому целью настоящей работы явилась сравнительная оценка содержания 17 цитокинов, относящихся к различным, функционально значимым группам, в сыворотке и в цельной крови здоровых доноров, как в режиме спонтанной продукции, так и при митогенной стимуляции.
Материалы и методы
В исследование были включены 39 практически здоровых доноров крови, представленных лицами обоего пола (20 мужчин и 19 женщин) в возрасте от 20 до 58 лет (средний возраст 37 + 2 лет). Периферическую кровь забирали разовым шприцем из локтевой вены и инкубировали в стерильной пробирке 1 ч при комнатной температуре и 1 ч при 4°С. Затем, после центрифугирования при 3000 об./мин в течение 10 мин, собирали сыворотку, которую замораживали и хранили до тестирования при -20°С.
Дополнительно у 11 доноров (5 мужчин и 6 женщин, в возрасте от 23 до 42 лет) часть венозной крови добавляли в стерильную пробирку, содержащую гепарин (20 ЕД/мл), и тщательно перемешивали. Затем 1 мл цельной гепаринизированной крови смешивали с 4 мл среды RPMI-1640 (Sigma, USA), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера и 100 мкг/мл гентамицина, т.е. кровь разводили в 5 раз. Подготовленные таким образом образцы крови (по 1 мл) культивировали в круглодонных, стерильных пробирках в присутствии липополисахарида (ЛПС, Escherichia coli 0111:B4 (Sigma), в конечной концентрации 10 мкг/мл) или конканавалина А (КонA, Sigma, в конечной концентрации 15 мкг/мл), а также в отсутствие митогенной стимуляции. Культивирование проводили при 37 °С в СО2-инкубаторе в течение 24 ч, после чего осторожно отбирали супернатанты (аликвотами по 0,2 мл) и хранили полученные образцы при -20 °С до тестирования. В данной подгруппе доноров в день гемоэксфузии на гемоанализаторе "HEMA-Screen 13" (Швейцария-Италия) проводился общий анализ крови с целью определения абсолютного количества мононуклеарных клеток (лимфоцитов и моноцитов).
Содержание в сыворотке, а также в супернатантах цельной крови 17 цитокинов (IL-1b, TNFa, IFNg, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, МСР-1, MIP-1b) оценивали методом проточной флюориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя [6, 15]. Анализ содержания цитокинов проводили тремя независимыми экспериментальными сериями, при этом значения цитокинов, как в стандартных калибровочных разведений, так и в тестируемых образцах, были хорошо воспроизводимы. Сывороточную концентрацию цитокинов выражали в пкг/мл, тогда как уровень продукции цитокинов в цельной крови пересчитывали индивидуально с учетом абсолютного количества мононуклеарных клеток (МНК) и выражали в пкг/мл/106 МНК.
Математическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ "Statistica 5.0". Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирману. При статистической обработке значения цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода (<э 2 пкг/мл), принимали за 1 пкг/мл.
Если Вы хотите прочесть статью целиком, заказывайте компакт-диск,
на котором Вы найдете ВСЕ статьи ВСЕХ номеров журнала за 2005 и 2006 годы!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!
Начата подписка на 2011 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
