197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 234 16 69, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 234 94 89
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2008, № 2

ЛЕЧЕБНЫЙ ЭФФЕКТ СИСТЕМНОЙ АНТИЦИТОКИНОВОЙ ТЕРАПИИ ИНГИБИТОРОМ ЯДЕРНОЙ ГИСТОНДЕАЦЕТИЛАЗЫ SAHAНА МОДЕЛИ ИШЕМИЧЕСКОЙ-РЕПЕРФУЗИОННОЙОСТРОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У МЫШЕЙ

А.Г. Соловьев, V. Melnikov, L.L. Reznikov, П.Г. Назаров, C.A. Dinarello

На ишимечески-реперфузионной модели острой почечной недостаточности (ОПН) у мышей разработана схема предупреждения ОПН с помощью введения препарата SAHA (ингибитора гистондеацетилазы субероиланилидгидроксамовой кислоты), надежно обеспечивающая хороший ренопротективный эффект. Эффект SAHA, вероятнее всего, обусловлен подавлением продукции провоспалительных цитокинов (TNF?, IL-1?, IL-18 и др.). Перспективным для разработки терапевтических антицитокиновых фармакологических схем кажется сочетание SAHA с ингибиторами ангиотензин-конвертирующего фермента (например, каптоприлом), блокаторами iNO-синтазы (пентоксифиллином, L-NAME) и др. Результаты исследования могут быть полезны при разработке стратегий лечения больных в сердечно-сосудистой хирургии, медицине катастроф (геморрагические, токсические шоки с гипотензией), неотложной токсикологии и инфекционно-токсических шоках, практике лечения синдрома полиорганной недостаточности в отделениях ОАРИТ. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 2. С. 38-44.)

Острая почечная недостаточность (ОПН) была и остается одним из грозных осложнений в практике врачей различных специальностей и в значительной степени влияет на общий исход основного патологического процесса и смертность. Особую значимость это осложнение приобретает в практике врачей отделений интенсивной терапии. По данным медицинского cтрахования США (Medicare), на ОПН приходится 23,8 случаев на каждую 1000 всех поступлений в клиники США [30], смертность в течение 90 дней после выписки из стационара при этом остается высокой - 34,5?% при изолированной ОПН и 48,6?% при вторичной ОПН - как результат основного заболевания [18, 30]. Также установлено, что при ОПН, возникшей вследствие сепсиса, смертность значительно выше (74,5?% [(21]), чем при ОПН, возникшей как осложнение других состояний (45,2?% [21]). ОПН при критических состояниях возникает как компонент синдрома полиорганной недостаточности, но на данный момент также имеются доказательства того, что тяжесть подобных состояний не может быть объяснена исключительно исходными патологическими факторами. Т. е. ОПН - это состояние, которое, возникнув, может самостоятельно приводить к дальнейшим непочечным осложнениями, значительно снижающим выживаемость, и должно рассматриваться не как курабельное осложнение основного заболевания [16], а как самостоятельный синдром. Важную роль играет также предотвращение ОПН при сердечно-сосудистых операциях [10], трансплантациях почек, тяжелых эндотоксикозах.

В мировой медицинской литературе широко освещаются различные факторы, воздействие которых приводит к острому и хроническому повреждению почечной паренхимы (гломерулосклерозу, тубулоинтерстициальным повреждениям, аккумулированию экстрацеллюлярного матрикса и др.) [6, 14, 28]. Публикации последних лет ясно показывают, что развитие прогрессирующих почечных заболеваний более связано с патологическими событиями в тубулоинтерстициальном компартменте независимо от того, какой индуцирующий фактор имел место, а развитие этих процессов не может быть объяснено исключительно ишемическими, склеротическими или токсическими влияниями. Возрастает уверенность в том, что прогрессирование почечных заболеваний в значительной степени связано с клеточными и/или воспалительными механизмами и, следовательно, более глубокое понимание этих механизмов может указать пути для повышения эффективности терапевтических вмешательств и, возможно, будет способствовать разработке новых подходов к лечению патологии почек.

По данным R. Schrier, W. Wang [24], главными повреждающими событиями в почечной паренхиме при сепсисе являются следующие.

• Гипотензия ? активация симпатической нервной системы и нейро-эндокринного ответа ЦНС (аргинин-вазопрессин или АДГ) ? выброс катехоламинов и активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, эндотелин 1 [1] ? вазоконстрикция сосудов почек ? ишемия.
• Активация iNOS-синтазы, повышение синтеза эндотелиальной и внутриклеточной NO ? системная артериальная вазодилатация и снижение артериального давления ? снижение фильтрационного давления в почках и ишемия ? активация NF?B и связанного с ним провоспалительного цитокинового каскада.
• LPS индуцирует синтез TNF? и радикалов кислорода, которые, кроме того, что обладают собственным повреждающим действием, способны еще реагировать с NO с образованием токсичного пероксинитрида ? повреждение канальцев, снижение уровня фильтрации в клубочках.
• Цитокины, хемокины, адгезионные молекулы: при ангиоспазме в ранней стадии активируются каспазы ? индукция синтеза IL-1?, IL-18 ? увеличение выработки адгезионных молекул, нейтрофильная инфильтрация и дальнейшая экспрессия цито- и хемокинов в рамках запущенного воспалительного процесса.
• LPS и C-реактивный белок активируют систему комплемента и повышение содержания компонента комплемента C5a, обладающего прокоагулянтными свойствами, что приводит к микротромбозам и дальнейшему ишемическому повреждению.
• Гиперкатехоламинемия ? гипергликемия ? нарушение функций лейкоцитов и макрофагов ? воспаление.
• Развитие ДВС синдрома (Disseminated Intravascular Coagulation Syndrome) ? тромбоз сосудов микроциркуляции ? ишемия.

Данные литературы широко освещают цитокиновые провоспалительные каскады, которые запускаются в результате названных процессов. Так, прессорный гормон ренин-ангиотензиновой системы ангиотензин 2 инициирует выработку IL?1?, TNF?, IL-8 [25], эндотоксины (LPS) также индуцируют еще и IL-12 [7] в клетках крови человека in vitro. LPS вызывает синтез IL-6, TNF?, эндотелина 1 [1], окиси азота (NO) эндотелиальной и активируемой NO-синтазами (e-NOS и i-NOS, соответственно) клетками почечного эпителия крыс in vitro [20]. Эндотелин 1 сам по себе способен активировать провоспалительную цитокиновую цепочку транскрипционного фактора NF?B, а также усиливать выработку свободных радикалов кислорода (ET-ROS) под влиянием эндотелина [11].

Многие авторы указывают на значительную повреждающую роль IL-18 [18, 22], IL-1? и NO [13] (как одного из индукторов синтеза TNF? и IL-1? [13]) при использовании ишемически-реперфузионной модели ОПН. Доказано, что LPS, TNF? и IL-1? вызвают апоптоз клеток почечных канальцев человека in vitro [12]. Предлагается использовать оценку содержания IL-18 в моче человека в качест-ве диагностического критерия острого канальцевого некроза [22].

В то же время специфическая антицитокиновая терапия, направленная на снижение воспаления по тому или иному пути, демонстрирует неплохой эффект. Так, защита почек была достигнута применением IL-10 при ишемическом и токсическом (цисплатин) повреждении почек у мышей [8], блокадой рецептора эндотелина 1 c помощью антагониста CPU0213 [4, 11] на модели острого повреждения толстой кишки (сепсис) у крыс, блокадой TNF?, IL-18, IL-1?. Ренопротективный эффект был также достигнут блокадой iNO-синтазы и ICAM-1 пенто-ксифиллином [29], что привело к депрессии синтеза TNF? и IL-1? у мышей. Красноречивые результаты по лечению ОПН у мышей были получены после упреждающего ишемическое повреждение применения растворимого рецептора TNF? (TNFsRp55) [13] или анти-IL-18 сыворотки [18]. Дефицитные по каспазе-1 [18] или лишенные нейтрофилов нормальные [19] мыши были в значительной степени устойчивы к ишемическому повреждению без всякого лечения. Заслуживают также внимания опыты по блокированию провоспалительного действия ренин-ангиотензин-альдостероновой системы in vivo и in vitro. В частности, каптоприл блокирует TNF?-индуцированный синтез IL-1? моноцитами человека [2, 25], а сочетание препаратов лизино-прила (ингибитора ангиотензин-конвертирующего фермента (ACEi)) и L-аргинина снижало уровень эндотелина 1 и имело клинический эффект при пассивном нефрите Хейманна [31].

Поскольку большинство патологических событий в паренхиме почек при эндотоксикозе (LPS-модель), токсическом воздействии (HgCl2 или цисплатин) и ишемии так или иначе связано с активацией провоспалительных цитокиновых каскадов, мы предположили, что рациональная неспецифическая антицитокиновая терапия должна эффективно предупреждать развитие ОПН. В качестве модели повреждения почек была выбрана ишемически-реперфузионная модель ОПН у мышей, поскольку ишемия является компонентом повреждающего воздействия при сепсисе, а также может встречаться изолированно. Другими словами, ишемия - более "универсальный" повреждающий фактор. Антицитокиновым агентом был выбран препарат SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid).

SAHA и его свойства. Процессы регуляции экспрессии генов в ядре регулируются парой групп ферментов: гистонацетилтрансферазой (HACs) и гистондеацетилазой (HDACs) [17], которые отвечают за состояние ядерных белков гистонов, т. е. за доступность генетической информации к считыванию в РНК. Ингибирование тех или иных HDACs приводит к нарушению транскрипции небольшого количества генов и, как следствие, к остановке роста, дифференциации и/или апоптозу опухолевых клеток различной природы [17]. В 2001 г. в Мемориальном центре исследований рака Слоан-Кеттеринга в Нью-Йорке была синтезирована целая группа сложных гибридных полярных молекул с активностью как индукторов дифференциации опухолевых клеток, так и их апоптоза [5]. Все эти соединения обладали мощным свойством ингибировать HDACs. SAHA - один из новых препаратов этого класса, и сейчас идет его широкое тестирование в качестве противоопухолевого препарата [5, 23] в экспериментальных и клинических условиях.

Учитывая механизм его фармакологического действия, следует ожидать от SAHA множества разных эффектов, помимо цитостатического дей-ствия. В частности, многими отмечается его неспецифический антицитокиновый эффект in vivo и in vitro. Taк, SAHA блокирует LPS-индуцированный синтез TNF?, IL-1?, IL-6 и IFN? у мышей [15]; в зависимости от дозировки, снижает синтез NO в культуре макрофагов мышей, стимулированных сочетанным воздействием TNF? и IFN? [15]; LPS-стимулированная культура периферических мононуклеаров крови человека также отвечала значительным снижением синтеза всего каскада провоспалительных интерлейкинов TNF?, IL-1?, IL-12, IFN?, IL-18 в присутствии SAHA в дозе 100-200 нМ.

Материалы и методы

Определение содержания интерлейкинов производили методом жидкостной электрохемилюминесценции (ЭХЛ) [9]. Очищенные моноклональные мышиные антитела против измеряемого цитокина метили биотином (Igen Inc., USA). Другие мышиные антитела к тому же цитокину (R&D Systems, USA), реагирующие с другим эпитопом, метили хелатом рутения (II) по методике производителя измерительного прибора Origen Analyzer (Igen Inс. USA). 25 мкл биотинилированного антитела (1 мг/мл в ЭХЛ-буфере [9] инкубировали 30 мин при комнатной температуре с 25 мкл суспензии покрытых стрептавидином парамагнитных бус (1 мг/мл, Dynal, USA). Затем к смеси добавляли 25 мкл супернатанта, исследуемого на содержание цитокина, или стандартных концентраций рекомбинантного цитокина. Наконец, добавляли 25 мкл рутенилированных антител (1 мкг/мл в ЭХЛ-буфере), пробирки встряхивали в течение 2 ч или ночи при комнатной температуре. Реакцию гасили добавлением 200 мкл фосфатного буфера и измеряли на приборе Origen Analyzer (Igen Inc., USA).

Протокол ишемии-реперфузии почек. Данный протокол принят и одобрен комитетом по этике и гуманному отношению и использованию лабораторных животных Health Science Centre University of Colorado, USA. Самцы мышей линии C57BL/6 массой 20-25 г получали общую анестезию и наркоз внутрибрюшинным введением препарата Авертин (Avertin, 2,2,2-tribromoethanol; Sigma-Aldrich, USA). Выполняли срединный разрез, выделяли почечную сосудистую ножку и клампировали симметрично с двух сторон на 22 мин микрососудистым зажимом. Время для ишемии выбирали с целью вызвать обратимую ОПН и избежать смерти животных. Затем зажимы снимали, почки оценивали на предмет восстановления кровотока - реперфузии, брюшную стенку глухо ушивали двухслойным швом, внутрибрюшинно вводили антибиотик пенициллин в дозе согласно массе тела. Контрольной группе операцию проводили так же, но сосудистые ножки не пережимали (группа ложнооперированных животных). Экспериментальной группе вводили SAHA в/б и per os в разных дозах в пределах от 10 до 100 мг/кг. Время и путь введения подбирали предварительно. В течение 24 ч реперфузионного периода животные находились в инкубаторе при температуре 29 °С. Образцы крови получали трансторакальным пунктированием сердца через 24 ч после операции. Креатинин и азот мочевины крови (BUN) определяли на автоматическом анализаторе Astra Autoanalyzer (Beckman Instruments Inc., USA) в соответствии с инструкцией производителя.

Гистологическое исследование. Фиксированные 4?% параформ-альдегидом и импрегнированные парафином, образцы почек нарезали микротомом толщиной 4 мкм, прокрашивали гематоксилином и эозином, а также по Шиффу, используя стандартные методики. Гистологические изменения, соответствующие острому канальцевому некрозу, количественно оценивали исходя из следующих критериев: подсчет процента канальцев, демонстрирующих канальцевый некроз (потеря щетинистой каемки, отслойка, расширение канальца: 0?=?нет, 1?=??"?10?%, 2?=?11-25?%, 3?=?26-45?%, 4?=?46-75?%, 5?=??"?76?%). При увеличении???200 на каждом стекле оценивали 5-10 полей. Полученный показатель в баллах (ATN-score, или индекс острого некроза канальцев) отражает степень анатомического повреждения почечной паренхимы.

Иммуногистохимия. Иммуногистохимическое исследование проводили на фиксированных параформальдегидом и импрегнированных парафином срезах почек. Препараты обрабатывали в соответствии с протоколом авидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Парафиновые срезы депарафинировали, регидратировали, активность эндогенной пероксидазы ингибировали, препараты инкубировали с 3?% сывороткой крови осла в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР) в течение 1 ч. Затем препараты инкубировали с козьими поликлональными анти-IL-18 антителами (разведение 1:50). После инкубирования с вторичными биотинилированными антителами препараты обрабатывали авидин-биотин-пероксидазным комплексом (все реагенты от Santa Cruz Biotechnology Inc.). Связанную с антителами пероксидазу визуализировали с помощью хромогена 3,3'-диаминобензидина. Снимки делали с помощью оптического микроскопа высокого разрешения и цифровой камеры Nikon (Nikon Instruments Inc., USA).

Статистический анализ. Ненормально распределенные данные анализировали непараметрическим тестом Манна - Уитни, сравнение между группами производили тестом ANOVA c поправкой Newman-Keuls. Программное обеспечение StatviewTM 512?+?(BrainPower, Inc. Calabasas, CA) для Apple Mac.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2006 год.


Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2007 год.