197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 234 16 69, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 234 94 89
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2008, № 3

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ИНДУКЦИИАНТИТЕЛ К IFNγ И IL-4 У МЫШЕЙ

С.В. Шевелев, А.Н. Митин, М.Ф. Никонова, А.А. Бабахин, А.А. Ярилин

Оценивали различные формы иммунного ответа у мышей, в сыворотке которых присутствуют антитела к ключевым цитокинам Th1- и Th2-клеток (IFNγ и IL-4), индуцированные иммунизацией пептидными фрагментами этих цитокинов. Обнаружено усиление спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации лимфоцитов селезенки мышей, иммунизированных против IFNγ. Способность CD4+ T-клеток иммунизированных мышей дифференцироваться в Th1- и Th2-клетки in vitro не изменяется, но при введении в культуры спленоцитов аутологичных сывороток, содержащих антитела к IFNγ или IL-4, подавляется дифференцировка Т-хелперов, продуцирующих соответствующие цитокины. Накопление антител к IFNγ приводит к подавлению как клеточного, так и гуморального иммунного ответа на эритроциты барана, но не влияет на образование реагинов при иммунизации овальбумином. Накопление антител к IL-4 подавляет гуморальный, но не клеточный ответ на эритроциты барана. Ингибирующее действие антител к IL-4 на аллергический ответ выявляется при раздельном анализе уровня реагинов у мышей с высоким и низким содержании антител к IL-4. (Цитокины и воспаление. 2008. Т.7, № 3, с. 3-8)

Общеизвестно, что поляризация Th1/Th2-баланса в сторону одного из типов хелперных Т-клеток благоприятствует формированию иммунопатологии: преобладание Th1-клеток способствует развитию клеточных аутоиммунных процессов, Th2-клеток - аллергии [17]. На этом основаны методы антицитокиновой иммунотерапии, состоящие в избирательном подавлении того или другого Т-хелперного звена [7, 8]. Чаще всего с этой целью используют введение гуманизированных моноклональных антител к ключевым цитокинам Th1- и Th2-клеток или к цитокинам, ответственным за их дифференцировку [11, 18]. Хотя клиническая эффективность такого подхода пока незначительна [4, 5, 14], поиски в данном направлении продолжаются. В качестве альтернативы введению готовых экзогенных антител может быть предложен подход, основанный на индукции эндогенных антител.

Существует и другой аспект изучения эффектов эндогенных антител к цитокинам. Описаны случаи спонтанного и вызванного цитокинотерапией образования аутоантител к цитокинам у людей [16, 19]. Биологическое действие таких антител практически не изучено. Создание экспериментальной модели животных - носителей эндогенных антител к цитокинам - позволило бы прояснить вопрос о биологической активности индуцированных и спонтанно возникающих антител к цитокинам и их влиянии на функционирование иммунной системы.

В данной статье представлен материал по оценке различных проявлений иммунного ответа у мышей, в сыворотке которых присутствуют антитела к IFNγ или IL-4, индуцированные иммунизацией пептидными фрагментами этих цитокинов.

Материалы и методы

Работа выполнена на мышах линии BALB/c и гибридах (СBAxС57Bl/6)F1 массой 20-22 г, а также крысах Wistar, полученных из питомника РАМН "Столбовая" и содержавшихся на обычном пищевом рационе.

Методы расчета иммунодоминантных эпитопов и синтеза соответствующих пептидов описаны ранее [1, 11, 12].

Мышей иммунизировали конъюгатами фрагмента 99-113 из IFNγ и 21-40 из IL-4 внутримышечно 3 раза с интервалом в 1 месяц; первую иммунизацию осуществляли в полном, две последующие - в неполном адъюванте Фрейнда. Контрольным мышам в соответствующие сроки вводили физиологический раствор (контроль-1) или адъювант (контроль-2). Антитела к пептидным фрагментам, а также целым молекулам цитокинов определяли иммуноферментным методом с оценкой оптической плотности (ОП) при разведении сывороток 1:100 и титра антител (последнее разведение, при котором ОП превышала 0,25).

Пролиферацию клеток оценивали по разведению флюоресцентной метки CFSE [5(6)-carboxyfluoresceindiacetate N-succinimidyl ester]. Для мечения флюорохромом мононуклеары инкубировали с 5 мкМ CFSE ("Fluka") 10 мин при 37° и 5% СО2, трижды отмывали охлажденной (4 °С) средой RPMI 1640, содержащей 10 % сыворотки эмбрионов телят (СЭТ, "Sigma", USA), и доводили до нужной концентрации [15]. Мононуклеары, меченные CFSE, культивировали в концентрации 2x10⁶/мл в 96-луночных плоскодонных планшетах ("Nunc", Дания) в присутствии конканавалина А (КонА, 5 мкг/мл) или без митогена в течение 3 суток при 37°С и 5 % СО2. С помощью проточной цитометрии на лазерном цитофлюориметре FACSCalibur ("Becton Dickinson", USA) определяли процент клеток, прошедших, по меньшей мере, одно деление (т. е. содержащие, как минимум, в 2 раза меньше флуорохрома, чем исходно меченые клетки).

Для оценки продукции цитокинов [13] клетки селезенки мышей (после лизиса эритроцитов и отмывания клеток) стимулировали in vitro форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) ("Sigma", USA, 10 нг/мл) и иономицином ("Sigma", 2 мкМ) в присутствии ингибитора секреторного процесса брефелдина ("Becton Dickinson", USA, 1 мкг/мл) и культивировали в концентрации 1x10⁵ клеток на лунку в течение 18 ч при 37°С и 5% CO2 в RPMI 1640 c добавлением 10 % СЭТ и 2 мМ L-глютамина ("Sigma"). После завершения культивирования клетки отмывали, фиксировали 4%-ным параформальдегидом ("Sigma") и пермеабилизировали в течение 20 минут при комнатной температуре в 0,1% растворе сапонина ("Sigma") на забуференном физиологическом растворе, рН 7,2. Клетки окрашивали в течение 20 минут с помощью моноклональных антител к IFNγ или IL-4, меченых флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) и моноклональных антител к CD3, меченых фикоэритрином (ФЭ) ("Caltag"). Отмытые клетки анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur.

Для индукции гуморального иммунного ответа мышей иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана (108). На 5-е сутки после иммунизации в селезенке мышей методом бляшкообразования определяли число клеток, секретирующих антитела [6]. Рассчитывали число антителообразующих клеток (АОК) на селезенку и на 1 млн кариоцитов.

Клеточный иммунный ответ оценивали по выраженности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана. Для ее индукции мышей иммунизировали эритроцитами барана внутрибрюшинно в дозе 5x10⁸. Через 6 суток им в стопу вводили эритроциты (108 в объеме 30 мкл); в контрлатеральную стопу вводили физиологический раствор в том же объеме. Через 24 ч измеряли толщину обеих стоп с помощью штангенциркуля. Рассчитывали индекс ГЗТ - (О-К)/К, где О - толщина опытной, К - контрольной лапки.

Аллергический ответ мышей индуцировали иммунизацией куриным овальбумином ("Sigma") в алюминиевых квасцах (50 мкг белка в 2,5 мг квасцов на мышь) [9]. Иммунизацию осуществляли 3 раза с интервалом 2 недели. Через 14 суток после последней инъекции у мышей брали кровь и определяли титр реагинов в реакции пассивной кожной анафилаксии (РПКА). Для этого 30 мкл сыворотки крови в серийных разведениях вводили внутрикожно в кожу живота крыс. В качестве контроля вводили сыворотку неиммунизированных мышей. Через 24 ч крысам вводили внутривенно 250 мкг овальбумина в 0,5 % растворе синьки Эванса. Через 30 минут крыс забивали под эфирным наркозом и регистрировали наличие пятна, окрашенного синькой, на внутренней поверхности кожи (в контроле окрашенное пятно не формируется). Титр РПКА оценивали как логарифм последнего разведения сыворотки, вызвавшего развитие реакции.

Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики (с применением программы Microsoft Excel) с использованием критерия t Стьюдента. Кроме того, осуществляли корреляционный и регрессионный анализ.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2006 год.


Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2007 год.