E-mail: [email protected]
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'cytokines.ru', 2008, № 4

ПОКАЗАТЕЛИ КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТАПРИ ИММУНИЗАЦИИ МЫШЕЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНОЙНА ФОНЕ ЦИТОКИНОВ

Ж.И. Авдеева, С.Е. Акользина, Н.А. Алпатова, Т.Н. Никитина, Н.В. Медуницын

Экспериментальные исследования показали, что сочетанное использование при иммунизации культуральной антирабической вакциной концентрированной, очищенной методом ультрафильтрации (КОКАВ), рекомбинантных цитокинов человека IL-1? и TNF? в виде монопрепаратов, а также комплекса цитокинов (IL-1?, IL-2, TNF?) повышает протективное действие культуральной антирабической вакцины. У животных, иммунизированных КОКАВ на фоне введения цитокинов, наблюдается усиление антиген- и митоген-индуцированной и спонтанной пролиферации лимфоцитов, увеличение числа Т?хелперов и Т-клеток с цитотоксической/супрессорной активностью, повышение титра специфических вирус-нейтрализующих антител, а также увеличение числа Ia-положительных клеток во фракции лимфоцитов и макрофагов селезенки. (cytokines.ru. 2008. Т. 7, № 4. С.15-20.)

Ключевые слова: цитокины, бешенство, вакцинация, адъюванты, клеточный иммунитет.

Цитокины - естественные эндогенные регуляторы развития иммунного ответа, они осуществляют контроль за размножением и дифференцировкой предшественников иммунокомпетентных клеток, представлением антигена (АГ), дифференцировкой Т- и В-лимфоцитов, пролиферацией антиген-сенсибилизированных лимфоцитов [2, 3, 6]. В литературе имеются сообщения об использовании цитокинов (IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, G-CSF, IFN?) в качестве адъювантов, введение цитокинов при иммунизации приводит к усилению иммуногенных свойств вакцин [1, 4, 7-9, 13]. На экспериментальных моделях установлено стимулирующее действие IL-1 при вакцинации против гепатита В [14], IL-2 - при вакцинации против герпеса [15], IFN? - при вакцинации против малярии [11], TNF? - при иммунизации антирабической вакциной [5]. Показано, что профилактическое применение антирабической вакцины в сочетании с рекомбинантным человеческим IL-2 (рчIL?2) обеспечивало протективный эффект у мышей линии Swiss при их последующем заражении вирулентным штаммом "SAD", в то время как введение одной вакцины было не эффективно [10].

Цель работы - изучение протективного эффекта вакцинации и оценка показателей клеточного иммунного ответа экспериментальных животных, иммунизированных вакциной против бешенства на фоне введения цитокинов.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования по изучению адъювантных свойств цитокинов и оценке показателей клеточного иммунного ответа проведены на 1546 беспородных белых мышах массой 12-14 г и 210 мышах линии CBA массой 12-14 г. Животные получены из Центрального питомника лабораторных животных РАМН "Биомодель".

В работе использована культуральная антирабическая вакцина концентрированная, очищенная методом ультрафильт-рации (КОКАВ), инактивированная сухая. Экспериментальные исследования проведены с использованием коммерческих серий вакцины КОКАВ с иммуногенной активностью 13,80 МЕ и 5,62 МЕ (производство ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова, г. Москва).

Использованы следующие препараты рекомбинантных цитокинов человека:

- интерлейкин 1 бета (рчIL-1?) (ФГУП "Гос. НИИ ОЧБ" ФМБА России, Санкт-Петербург);

- интерлейкин 2 (рчIL-2) (ООО "Биотех", Санкт-Петербург);

- фактор некроза опухолей альфа (рчTNF?) (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", г. Бердск);

- тимозин альфа 1 человека рекомбинантный (Т?) (НИИ прикладной микробиологии, г. Оболенск);

- гибридный белок "неотим", состоящий из рчTNF? и тимозина альфа 1 (Т?-TNF-Т?) (НИИ прикладной микробиологии, г. Оболенск).

Все указанные препараты условно объединены под термином "цитокины".

Влияние цитокинов на протективный эффект антирабической вакцины определяли в тесте защиты иммунизированных мышей при заражении их фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS (Challenge virus standart). Вакцину и цитокины вводили животным одновременно внутрибрюшинно. Опытным группам животных вакцину КОКАВ вводили в разведениях 1:50, 1:500, 1:5000 или в разведениях 1:25, 1:125, 1:625 в сочетании с цитокинами, вводимыми в виде монопрепаратов или комплекса отдельных цитокинов. При использовании монопрепаратов вводимая доза для каждого из цитокинов - рчIL-1?, рчTNF?, Т? или Т?-TNF-Т? - составляла 1,0 мкг на мышь. Дозы цитокинов при использовании их в комплексе составляли: для рчIL-1? - 10 нг, для рчIL-2 - 10 МЕ, для рчTNF? - 10 ЕД из расчета на одну мышь. Контрольным группам животных вакцину КОКАВ вводили в тех же разведениях, что и опытным группам, но без цитокинов. Каждая группа, соответствующая одному из разведений вакцины, включала 10-15 мышей. Вакцину и цитокины вводили животным двукратно с интервалом в одну неделю.

На 8-й день после окончания иммунизации мышам вводили фиксированный вирус бешенства. Заражающая доза вируса при внутримозговом введении составляла 3,0-3,6 lg LD50 в объеме 0,03 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней, отмечая гибель животных, начиная с 6 дня после заражения. Эффективность вакцинации, при изолированном использовании вакцины КОКАВ или сочетанном ее применении с цитокинами, оценивали по числу выживших животных в каждой из групп, соответствующих разведению вакцины. Определяли процент выживших животных и величину предельно допустимого разведения вакцины, обеспечивающую 50%-ную выживаемость животных после заражения вирусом бешенства (КР50), рассчитанную по методу Reed-Muench [12].

Титр вирус-нейтрализующих антител (АТ) в сыворотке крови вакцинированных животных определяли в реакции биологической нейтрализации на беспородных белых мышах, массой 7-8 г. Кровь для получения сыворотки брали у животных на 7-е сутки после окончания иммунизации. Постановку реакции осуществляли, используя постоянную дозу вируса бешенства, штамм CVS (38 LD50) и 5-кратные разведения предварительно инактивированной сыворотки. Равные объемы вирус-содержащей жидкости и тестируемой сыворотки смешивали и выдерживали при 37 °С в течение 1,5 часов. Указанную смесь после инкубации реагентов вводили в мозг животных в объеме 0,03 мл. Наблюдение за мышами проводили в течение 14 дней, учитывая их гибель, начиная с 6 дня после инъекции. Определяли процент выживших животных и величину титра вирус-нейтрализующих антител.

Показатели клеточного иммунного ответа вакцинированных животных оценивали при тех условиях эксперимента, при которых было выявлено усиление протективного эффекта вакцины препаратами цитокинов. Клеточную форму иммунного реагирования оценивали по количественному содержанию Т-хелперов и Т-клеток с цитотоксической/супрессорной активностью, уровню экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса на иммунокомпетентных клетках, а также функ-циональной активности лимфоцитов (Лф), определяемой в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Показатели клеточного иммунного ответа оценивали на 5 сутки после введения препаратов.

Количественное содержание регуляторных субпопуляций Лф (Т-хелперов и Т-Лф с цитотоксической/супрессорной активностью), а также экспрессию продуктов генов МНС II класса (субрайонов IA и IE комплекса Н-2 мыши) на спленоцитарных Лф и макрофагах (Мф) мышей линии CBA определяли в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием соответ-ствующих специфических моноклональных антител (МкАТ). С этой целью были использованы анти-L3T4 и анти-Thy1,2 МкАТ ("Becton Dickinson", USA), анти-IA (супернатант гибридомы 10-2.16), анти-IE МкАТ (супернатант гибридомы 13/4). Содержание специфического иммуноглобулина в супернатантах гибридом составляло не менее 2,5 мкг/мл. При постановке реакции взвесь клеток (концентрация 1???106 кл/мл в среде 199 с 5% сывороткой плодов коровы) инкубировали с препаратами соответствующих МкАТ в 96-луночных планшетах ("Becton Dickinson", USA) в течение 30 минут при 4 °С. После отмывания клетки вновь инкубировали в течение 30 минут при 4 °С с препаратом FITC-меченных F(ab)2-фрагментов кроличьих антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши ("Becton Dickinson", USA). Затем клетки фиксировали 1% раствором параформальдегида ("Merck", Germany) в течение 15 минут при комнатной температуре и хранили планшеты при 4 °С не более 2 суток. Результаты учитывали на лазерном проточном цитофлюориметре "Epics C" ("Coultronics", France), определяя количество клеток, экспрессирующих указанные маркеры.

Постановку РБТЛ проводили с использованием оптимальных концентраций митогенов (ФГА - 10 мкг/мл, Кон А - 10 мкг/мл, ЛПС - 50 мкг/мл, "Sigma", USA) или специфического антигена вакцины против бешенства. Лимфоциты селезенки мышей (в конечной концентрации 1???106 кл/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плодов коровы, 2 мМ L-глутамина, 5???106 М 2-меркаптоэтанола, 1 мМ буфера HEPES и антибиотики), с добавлением указанных выше митогенов или антигена, культивировали в 96-луночных планшетах ("Becton Dickinson", USA). Взвесь клеток инкубировали в течение 72 ч при 37 °С в атмосфере 5% СО2. Пролиферативный ответ оценивали по интенсивности синтеза ДНК, с этой целью за 16 ч до окончания культивирования в культуры клеток вносили метил-3H-тимидин (74 кБк/мл). Счет радиоактивности проводили ?-счетчиком "BetaTrak", уровень пролиферации спленоцитов оценивали по числу импульсов в одну минуту.

Статистическую обработку данных проводили на ПК с использованием стандартного пакета статистических программ. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск cytokines.ru, 2008 год.