Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2008, № 4
|
Оригинальные статьи
|
Номер 4'2008
|
АКТИВАЦИЯ БАЗОФИЛОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ЛИГАНДАМИ FC?-РЕЦЕПТОРОВ: ХОЛИНЕРГИЧЕСКИЙ ТЮНИНГ
А.П. Пронина, П.Г. Назаров
Изучали возможность активации базофилов крови человека лигандами Fc?-рецепторов и влияния холинергического аппарата базофилов на выброс гистамина. Исследование проводили с обогащённой фракцией базофилов, для стимуляции базофилов использовали различные лиганды Fc?-рецепторов, для воздействия на холинергический аппарат клеток - агонисты и антагонисты ацетилхолиновых рецепторов (карбахолин, армин, метацин, гексаметоний). Выход гистамина определяли методом Шора. Экспрессию мембранного антигена CD203c - маркера активации базофилов оценивали проточной цитофлюориметрией. Результаты показали, что все лиганды Fc?-рецепторов (агрегированный IgG, С-реактивный белок, антитела к CD16 (Fc?-рецептору III типа)) активируют базофилы к секреции гистамина. Холинергическая стимуляция базофилов усиливает секрецию гистамина и зависит от активности ацетилхолиновых рецепторов мускаринового и никотинового типа. Холинергический тонус клетки влияет на характер ответа базофилов на лиганды Fc?-рецепторов. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 4. С. 42-48.)
Базофильные гранулоциты, или базофилы - это малочисленная популяция лейкоцитов периферической крови, содержащая цитоплазматические гранулы, которые окрашиваются основными красителями. Впервые базофилы были описаны в 1879 г. П. Эрлихом, который годом раньше открыл морфологически подобные клетки в тканях, которые он назвал Mastzellen, или тучными клетки.
Подобно тучным клеткам, базофилы имеют высокоаффинные рецепторы для иммуноглобулина IgЕ (Fc?RI), перекрестная сшивка которых соответствующими антигенами (аллергенами) приводит к высвобождению множества медиаторов, общих для обеих клеточных линий. Базофилы участвуют в аллергических реакциях и антипаразитарном иммунитете.
Данные последних лет расширили представление о роли базофилов в аллергических заболеваниях и иммунной защите. Было показано, что базофилы продуцируют и могут быстро выделять регуляторные цитокины, такие как IL-4 [4] и IL-13 [11]. Базофилы несут рецепторы CCR3 [6] и под влиянием CC-хемокинов (эотаксина, эотаксина-2, RANTES, MCP-2, 3, 4) мигрируют в места реакции на антиген, где повышают число IL-4-продуцирующих клеток. Они экспрессируют CD154 - лиганд CD40, с помощью которого контактируют с молекулой CD40 В-лимфоцитов, что, вместе с действием IL-4 и IL-13, способствует переключению В-клеток на синтез иммуноглобулинов класса IgE [8, 10]. Эти данные показывают, что роль базофилов не ограничивается эффекторными функциями в IgE-опосредованных реакциях.
Холинергическая регуляция активности тучных клеток и базофилов мало изучена, особенно с точки зрения возрастающего внимания к автономной не-нейрональной холинергической системе иммунокомпетентных клеток, которая включает такие элементы, как синтез ацетилхолина (АХ), его разрушение и АХ-рецепторы мускаринового и никотинового типа (мАХР, нАХР) [9, 16, 18].
Мало известно о связи базофилов с факторами острой фазы воспаления, в частности, с С-реактивным белком (CRP) и о характере влияния CRP на реакции гиперчувствительности немедленного типа. Повышенная экспрессия CRP, пентраксина и известного маркера острой фазы воспаления, сопровождает начало любой формы иммунного ответа [2]. Биологическая активность CRP зависит от его взаимодействия с клеточными Fc?-рецепторами (Fc?R) [12]. Показано, что CRP может специфически влиять на иммунные реакции в отношении антигенов, являющихся его лигандами, например, уменьшает продукцию защитных антител против фосфорилхолина (PC) клеточной стенки пневмококка [13]. CRP стимулирует фагоцитарную активность и другие функции макрофагов и нейтрофилов. Влияние CRP на функции базофилов и тучных клеток практически не изучено.
Целью работы было изучение возможности активации базофилов крови человека лигандами Fc?-рецепторов и влияния холинергического аппарата базофилов на выброс гистамина. Исследование проводили с обогащенной фракцией базофилов, для стимуляции базофилов использовали агрегированный IgG человека, С-реактивный белок и моноклональные антитела против CD16, для воздействия на холинергический аппарат клеток - агонисты и антагонисты ацетилхолиновых рецепторов.
Материалы и методы
Базофилы выделяли из 30-40 мл гепаринизированной крови здоровых доноров, содержащей 50 ед/мл гепарина. На первом шаге протокола готовили смесь лейкоцитов путем спонтанного осаждения эритроцитов (в течение 30 минут при 37 °C) либо получали фракцию мононуклеарных клеток периферической крови центрифугированием на градиенте Ficoll-Paque (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) с плотностью 1,077 г/см3. Для получения фракции, обогащенной базофилами, использовали систему Basophil Isolation Kit II human (Miltenyi Biotec) для непрямого магнитного выделения базофилов из суспензии человеческих мононуклеаров крови. Клетки, не являющиеся базофилами (Т- и В-лимфоциты, НК, моноциты, дендритные клетки, эритроциты, тромбоциты, нейтрофилы, эозинофилы) обрабатывали сначала коктейлем биотин-коньюгированных антител против спектра клеточных антигенов, отсутствующих на базофилах, но представленных на других клетках крови - CD3, CD4, CD7, CD14, CD15, CD16, CD36, CD45RA, HLA-DR и CD235a, а затем инкубировали с магнитными микробусами, конъюгированными с антителами к биотину. Не-базофилы прикреплялись к бусам и удалялись магнитом. Высоко очищенные базофилы выходили с колонки как не прикрепившаяся к бусам фракция. Магнитную сепарацию производили в магнитном поле сепаратора (Miltenyi Biotec). Для этого в магнит помещали LS-колонку, в которую вносили смесь клеток. Фракция, полученная после прохождения через колонку, представляла собой обогащенные базофилы, которые мы рассматривали как интактные, так как они не контактировали с антителами.
Контроль чистоты базофилов осуществляли проточной цитометрией на цитофлюориметре Epics Altra Cell Sorter (Beckman-Coulter) с использованием ФИТЦ-меченых моноклональных антител против CD203c. Мембранный антиген CD203c - член мультигенного семейства эктонуклеотидпирофосфатаз/фосфодиэстераз (E-NPPs), экспрессируется исключительно на человеческих базофилах и тучных клетках [5, 7, 15]. После активации базофилов экспрессия CD203c увеличивается.
Для активации базофилов использовали следующие препараты: 1) нормальный человеческий донорский иммуноглобулин (IgG, НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург), агрегированный (в виде раствора в концентрации 10 мг/мл в физиологическом растворе) нагреванием на водяной бане при 63 °С в течение 10 мин; C-реактивный белок человека (MB Biochemicals), который перед использованием диализовали против забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР) в течение 24 часов при 4 °С; мышиные моноклональные антитела против CD16 человека (низкоаффинных рецепторов Fc?RIII) ("Медбиоспектр", Москва), которые перед использованием также подвергали диализу для удаления консерванта; липополисахарид S. typhi (ЛПС, НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург).
Для изучения влияния холинергических агентов на базофилы использовали следующие препараты: неметаболизируемый химический аналог ацетилхолина карбамоилхолин (карболхолин, КХ; Sigma-Aldrich), н-холинолитик гексаметония безолсульфонат (1,6-бис-(N-триметиламмоний)гексана дибензолсульфонат, бензогексоний, 2,5%-ный раствор, Фармацевтическая компания "Здоровье", Харьков, Украина); м-холинолитик метацин (метоциния йодид, 1 мг/мл, Ай Си Эн Октябрь, Россия); необратимый ингибитор ацетилхолинэстеразы армин (0,01%-ный раствор, ПО "ТАТХИМФАРМПРЕПАРАТЫ", Казань, Россия).
Опыты по изучению влияния препаратов на базофилы ставили следующим образом. Суспензию базофилов в количестве 105 клеток в 800 мкл ЗФР вносили в пластиковые пробирки типа "эппендорф" вместимостью 1,5 мл. К суспензии добавляли исследуемые препараты в объеме 160 мкл в следующих финальных концентрациях: агрегированный IgG человека - 300 мкг/мл; CRP человека - 10, мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл; моноклональные антитела к CD16 - в финальном разведении 1/50; метацин - 0,17 мг/мл и 0,017 мг/мл; карбахолин - 0,15-1,5 мг/мл; гексаметоний - 4,16 мг/мл; армин - 2 мкг/мл; ЛПС - 25 мкг/мл. Общий объем пробы составлял 960 мкл. Разведения препаратов готовили на ЗФР. В части опытов исследовали совместное влияние на базофилы двух препаратов одновременно: агрегированного IgG (или CRP) и холинергических агентов, или CRP и антител к CD16, и т.п. (варианты совместного действия разных препаратов на клетки приводятся в разделе "Результаты и обсуждение"). Негативным контролем служили пробирки с клетками, в которые добавляли адекватный объем ЗФР, позитивным - пробирки, куда добавляли неспецифический либератор гистамина вещество 48/80 (Sigma-Aldrich) в концентрации 1 мг/мл.
Суспензии базофилов с препаратами инкубировали 30 мин при 37?°С, после чего быстро охлаждали для остановки реакции, помещая на лед. Клетки осаждали центрифугированием при 600 g в течение 10 мин и отбирали супернатанты для измерения концентрации гистамина.
Содержание гистамина оценивали планшетной модификацией метода Шора [17] с регистрацией флюоресценции комплекса гистамина с о-фталевым альдегидом (MB Biochemicals) на спектрофлюориметре Viktor-2 (PerkinElmer) при длинах волн 355/460 нм. Результаты измерений, выраженные числом импульсов в секунду, пересчитывали в число нанограммов гистамина в миллилитре (нг/мл) по калибровочной кривой, которую строили в каждом опыте по восьми концентрациям (1,78 - 100 нг/мл) стандартного раствора гистамина (гистамин дигидрохлорид, MB Biochemicals).
Полученные данные представлены как выход гистамина из базофилов в нг/мл, в виде средней арифметической и стандартной ошибки средней, или в виде индекса стимуляции - отношения количества гистамина, выброшенного активированными клетками, к количеству гистамина, выделившегося спонтанно из базофилов, инкубированных в присутствии ЗФР. Статиcтический анализ проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента.
Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2006 год.
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2007 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
