197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2015, № 2

Стимуляция генов сигнальной трансдукции препаратами «Ридостин», «Циклоферон» и «Ингавирин»

Т.М. Соколова, А.Н. Шувалов, В.В. Полосков, Ф.И. Ершов

Наши данные впервые показывают, что препараты «Ридостин», «Циклоферон» и «Ингавирин», обладающие антивирусной и иммунорегуляторной активностью, стимулируют транскрипцию генов TLR- и RLR-рецепторов и факторов сигнальной трансдукции в клетках крови человека. Генные активности сопоставлены с уровнями индукции группы цитокинов (IFNα, IFNγ, TNFα, IL-1β и IL-10). Ридостин проявляет наиболее выраженные активности на генном и белковом уровнях. Препарат активирует транскрипцию нескольких генов сигнальных рецепторов (TLR3, TLR8, MDA), факторов (NF-κB , IRF3 и IRF7). Кратность стимуляции им генов IFNγ и белка Mx1 высокая. Циклоферонменее активен и преимущественно стимулирует ген рецептора TLR9 и слабее — IFN-зависимые гены. Ингавирин по действию на гены рецепторов TLR7 и MDA5 имеет сходство с зарубежным препаратом «Имиквимод» (Imiquimod). Ингавирин стимулирует гены IFNγ, белка Mx1 и фермента OAS1. Позитивно регулируя экспрессию генов TLR и RLR на уровне транскрипции, препараты повышают иммунный потенциал клеток крови. Избирательность в действии трех препаратов на транскрипцию генов в определенной степени коррелирует с «узнаванием» их молекулярных структур рецепторами врожденного иммунитета. IFN-индуцирующие свойства препаратов обусловливают существование у них дополнительных сигнальных механизмов, присущих препаратам IFN. (Цитокины и воспаление. 2015. Т. 14. № 2. С. 26–34.)

Ключевые слова: ридостин, циклоферон, ингавирин, сигнальная трансдукция, гены TLR и RLR, цитокины.

Медицинские препараты «Ридостин», «Циклоферон» и «Ингавирин», имеющие разную молекулярную и химическую структуру, широко применяются как антивирусные и иммуномодулирующие лекарственные средства [3]. Ридостин — смесь полимеров двуспиральных (дс) и односпиральных (ос) дрожжевых РНК Saccharomyces cerevisiae, имеет международное название «Рибонуклеат натрия» [1]. Циклоферон— низкомолекулярное соединение, N-метилглюкаминовая соль акридонуксусной кислоты. Препарат зарегистрирован в России с 1992 г., имеет патенты в США и Европе. Ингавирин (Витаглутам или Дикарбамин)по химической структуре — пентадионовая кислота имидазолэтаноламида, в России зарегистрирован с 2008 г. Несмотря на принадлежность к разным химическим веществам между препаратами «Ридостин», «Циклоферон» и «Ингавирин» имеется общая функциональная направленность на клеточном и организменном уровнях: антивирусное действие, активация иммунитета и системы интерферона (IFN).

Предполагается взаимодействие молекулярных структур исследованных препаратов с рецепторами врожденного иммунитета TLR и RLR, что приводит к активации сигнальных путей индукции синтеза IFN и провоспалительных цитокинов, описанных в литературе как сигнальная трансдукция [11, 23]. Поиск чувствительных мишеней на рецепторном уровне является одним из основных способов создания эффективных индукторов IFN, антивирусных и антивоспалительных препаратов [25].

Цель настоящего исследования — сравнительный анализ действия препаратов «Ридостин», «Циклоферон» и «Ингавирин» на генном уровне (транскрипция генов) и как индукторов цитокинов. Исследования выполнены ex vivo на клетках крови человека методами ОТ-ПЦР в режиме реального времени и иммуноферментного анализа (ИФА). В клетках крови представлен широкий набор рецепторов врожденного иммунитета, образуются IFN трех типов и множество цитокинов — регуляторов пролиферации и дифференцировки популяций лимфоцитов. Взаимодействие популяций Т- и В-лимфоцитов с дендритными клетками, макрофагами и другими моноцитами, позитивно регулирует адаптивный иммунный ответ [21]. Определена транскрипционная активность 12 генов, участвующих в процессах сигнальной трансдукции, 8 генов системы IFN и гена бета2-микроглобулина (B2M) «домашнего хозяйства». Параллельно в культуральной жидкости измерены количества IFN типов I и II и регуляторных цитокинов методом ИФА.

На рис. 1 схематично показаны сигнальные процессы, которые активируются IFN и, как мы предполагаем, индукторами IFN. Каскады начинаются с рецепторов врожденного иммунитета TLR, расположенных на мембране и в эндосомах клеток, а также цитоплазматических хеликаз — RLR [30]. Показаны предполагаемые рецепторные мишени взаимодействия с молекулярными структурами препаратов.

Группа TLR (TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9) и RLR (RIG1и MDA5) играет важную роль в передаче сигналов на гены IFN и воспалительных цитокинов.Согласно современным данным гены TLR и RLR относятся к группе IFN-регулируемых [22, 24]. Препараты IFN индуцируют экспрессию большой группы антивирусных, апоптозных и иммунорегуляторных генов и, одновременно, повышают распознавание патогенов с участием рецепторов врожденного иммунитета [27]. В какой мере эти свойства присущи индукторам IFN и антивирусным препаратам «Ридостин», «Циклоферон» и «Ингавирин» исследовано в настоящей работе.

Кратко опишем известные данные литературы, касающиеся биологических активностей исследованных медицинских препаратов. Действующей молекулярной структурой препарата «Ридостин» считается дрожжевая дсРНК. ДсРНК являются центральным индуктором системы IFN и активатором группы IFN-зависимых ферментов. ДсРНК образуются при репликации вирусов и становятся медиаторами индукции IFN при вирусных инфекциях. В связи с открытием большой группы дсРНК-связывающих белков и обнаружением явления РНК-интерференции интерес к механизмам их действия повышенный [10, 20]. ДсРНК-зависимые пути регуляции процессов сигнальной трансдукции, транскрипции и трансляции преимущественно были изучены на модели синтетического комплекса поли-(И:Ц) и некоторых вирусных РНК [28,31]. Такие исследования с препаратом «Ридостин» пока являются единичными [12].

В клинических исследованиях при различных патологиях получена многочисленная информация о хорошей лекарственной эффективности препарата «Циклоферон» [8]. Показана индукция синтеза IFN в организме человека этим препаратом [15]. Данные об его антивирусном действии в культурах клеток животного происхождения более ограничены [5]. Поиск чувствительных клеточных систем человеческого происхождения, в которых биологические эффекты циклоферона будут выраженными, продолжается. Пока отсутствует ясное понимание молекулярных механизмов действия этого препарата, хотя исследования c соединениями акридинов проводились [2, 18]. Согласно данным литературы, производные акриданонов ингибируют активность топоизомеразы, активируют апоптоз с участием белка р53 и взаимодействуют с белком STING в мышиных клетках [17, 32, 33]. По нашим данным, циклоферон в организме и в клетках крови человека стимулирует транскрипцию генов системы IFN и Fas-рецептора апоптоза [9]. Первые данные о сигнальных механизмах действия циклоферона, полученные нами недавно, показали стимуляцию транскрипции генов факторов IRF3 и B2M [13]. В настоящей работе мы более детально изучили его влияние на экспрессию генов сигнальных факторов и рецепторов и дополнили эту информацию.

Защитные гемопротективные эффекты препарата «Дикарбамин» (Ингавирин) первоначально были обнаружены у больных раком крови и затем выявлены при других видах злокачественных опухолей [7]. Включение дикарбамина в протокол лечения больных снижало токсические эффекты химиопрепаратов. В дальнейшем ингавирин стали широко применять при вирусных инфекциях и в настоящее время он широко известен как противогриппозный препарат [6]. Ингавирин оказывает антивирусное действие, снижая инфекционность и нарушая ультраструктуру вирусов гриппа [4]. У зарубежного препарата «Имиквимод» (Imiquimod), являющегося, как и ингавирин, имидазолсодержащим соединением с противоопухолевыми свойствами, обнаружено несколько сигнальных механизмов: взаимодействие с рецепторами TLR7/8 и рецептором аденозина, регулирующим активность АМФ-циклазы [29]. Дополнительно имиквимод индуцирует митохондриальный апоптоз и активирует киллерную активность плазматических дендритных клеток [19]. Нами впервые изучено действие ингавирина на большую группу генов рецепторов врожденного иммунитета и генов системы IFN.

Материалы и методы

Препараты. Ридостин— смесь натриевых солей односпиральных (ос)РНК и двухспиральных (дс)РНК, полученная из лизатов киллерных дрожжей Sacharomyces cerevisiae (ампула 5 мг, «Вектор-Медика», Россия; осРНК 1303 г/моль и дсРНК 2607 г/моль, содержание последней в препарате составляет 10 % по весу и соответствует 0,5 мг). Циклоферон— 12,5 % водный раствор N-метилглюкаминовой соли акридонуксусной кислоты (ампула 2 мл, НТФФ «Полисан», Россия). Ингавирин— пентадионовая кислота имидазолэтаноламида (аналоги — витаглутам, дикарбамин) выпускается в виде капсул, содержащих 90 мг действующего и вспомогательные вещества (ОАО «Валента Фармацевтика», Россия). Рекомбинантный IFNα2 — субстанция 10⁸ МЕ/мл («Фармапарк», Россия). Все препараты перед использованием растворяли в среде RPMI-1640.

Клетки и клеточные культуры.Цельную кровь с антикоагулянтом в день взятия разводили в 3 раза средой RPMI-1640 с глютамином, 10 % сывороткой плодов коров и антибиотиком гентамицином. Клетки разливали по 1 мл в стерильные пластиковые микропробирки с пробками и к ним добавляли растворы препаратов в дозах: ридостин — 100, 10 и 1 мкг/мл; циклоферон — 625, 62,5 и 6,25 мкг/мл; ингавирин — 450, 150 и 50 мкг/мл. В контрольные пробы препараты не добавляли. Все пробы инкубировали в термостате при 37 °С 24 ч, затем фракционировали центрифугированием при 3000 об/мин 5 мин. Из осадков клеток выделяли РНК для реакции ОТ-ПЦР, в надосадочной жидкости определяли содержание цитокинов.

ОТ-ПЦР в реальном времени. Подробное описание процедуры выделения РНК, обработки препарата ДНКзой, получения кДНК и проведения ПЦР-анализа в режиме реального времени на приборе CFX-96 («Bio-Rad Laboratories», США) приведены в нашей более ранней публикации [12]. Структуры рассчитанных олигонуклеотидных праймеров представлены в табл. 1 и частично были опубликованы ранее [12–14, 16]. Все праймеры были синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Полученный ПЦР-продукт соответствовал раcчетному по температуре плавления и подвижности в агарозном геле. Относительная оценка экспрессии генов (дельтаCq) сделана относительно контроля в программе CFX Manager («Gene expression») в автоматическом режиме.

Определение цитокинов(IFNα2, IFNγ, TNFα, IL-1β и IL-10) в культуральной жидкости выполнено с помощью ИФА-наборов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) согласно прилагаемой инструкции. Количественное измерение оптической плотности и расчет средних концентраций повторных образцов в пг/мл сделано на микропланшетном ридере (модель «Anthos 2010») в программе ADAP+ («Biochrom», Великобритания).

Статистическая обработка результатов. Результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Статистическую значимость различий средних проводили с использованием t-tests в программе «Medcalc». Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.