197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2016, № 1

Субпопуляционный состав Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при рассеянном склерозе

И.В. Кудрявцев, И.И. Кробинец, К.К. Минеев, М.К. Серебрякова, А.М. Петров, И.Д. Столяров

В периферической крови больных рассеянным склерозом (РС) с применением восьми-цветного цитометрического анализа проведено исследование субпопуляционного состава Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, выявленных на основании экспрессии CD27, CD28, CD45RA и CD62L. Для анализа полученных результатов использовали два алгоритма выделения субпопуляций. Первый подход основан на первоначальной оценке уровней CD45RA и CD62L, позволяющий выявить «наивные» клетки (CD45RA⁺CD62L⁺), клетки центральной (CD45RA^–CD62L⁺) и эффекторной (CD45RA^–CD62L^–) памяти, а также «терминально-дифференцированные» эффекторные клетки (CD45RA⁺CD62L^–). Второй подход основан на первоначальном определении уровней CD27 и CD28 с последующим анализом уровней CD45RA и CD62L на CD27⁺CD28⁺ Т-лимфоцитах. Это позволяет выявить «наивные» Т-клетки с фенотипом CD27⁺CD28⁺CD45RA⁺CD62L⁺, клетки центральной памяти — CD27⁺CD28⁺CD45RA^–CD62L⁺, переходные или «транзиторные» клетки памяти CD27⁺CD28⁺CD45RA^–CD62L^–, а также клетки эффекторной памяти и эффекторные клетки (CD27⁺CD28– или CD27^–CD28⁺, CD27^–CD28^–, соответственно). Показано, что относительное содержание «наивных» CD3⁺CD4⁺ и CD3⁺CD8⁺ клеток находилось в обратной зависимости от степени инвалидизации обследованных больных. В случае Т-хелперов относительное содержание клеток эффекторных субпопуляций — клеток «транзиторной» и эффекторной памяти, а также зрелых эффекторных клеток — возрастало по мере увеличение баллов EDSS. Можно предполагать, что при РС нарушения затрагивают, в первую очередь, процессы дифференцировки Т-хелперов, что еще раз указывает на ведущую роль данной популяции лимфоцитов в патогенезе данного заболевания. (Цитокины и воспаление. 2016. Т. 15. № 1. С. 91–99.).

Ключевые слова: проточная цитометрия, рассеянный склероз, субпопуляции Т-лимфоцитов, CD45RA, CD62L, CD27, CD28.

Рассеянный склероз (РС) относится к иммунологически опосредованным заболеваниям нервной системы с гетерогенным патогенезом, включающим развивающиеся в определенной степени независимо друг от друга аутоиммунные воспалительные реакции и нейродегенеративные процессы [6]. Одним из признаков РС является разрушение миелина в белом веществе отдельных участков головного и спинного мозга. В очагах демиелнинизации обычно обнаруживается высокое содержание лимфоидных клеток, проникших через гемато-энцефалический барьер [19]. Долгое время считалось, что ведущую роль в патогенезе РС играют аутореактивные клоны Т-хелперов различных субпопуляций, инфильтрирующие нервную ткань, но в последнее десятилетие активно стала обсуждаться роль цитотоксических Т-лимфоцитов в патогенезе этого заболевания [15]. Как Т-хелперы, так и цитотоксические Т-клетки формируют огромное число отдельных субпопуляций, обладающих различными функциональными характеристиками, к числу которых относятся способность к пролиферации и чувствительность к проапоптотическим сигналам, синтезу и секреции цитокинов, накоплению в цитоплазме эффекторных молекул и т. д. [более подробно в 1, 5]. К направленной миграции в периферические ткани способны только антиген-специфические Т-клетки, прошедшие антиген-зависимую дифференцировку в периферических лимфоидных органах и утратившие молекулы «хоуминга» в лимфоидную ткань, но обладающие выраженными эффекторными свойствами. Именно этим группам клеток отводится ключевая роль в развитии различного рода патологических состояний. Поэтому анализу уровня зрелости или степени дифференцировки Т-клеток в периферической крови отводится особое место в современных исследованиях, а оптимальным методом является многоцветная проточная цитометрия, позволяющая детально охарактеризовать фенотипические особенности лимфоцитов даже весьма «редких» клеточных популяций.

Материалы и методы

Объектом исследования служила венозная кровь, полученная пункцией локтевой вены и собранная в вакуумные пробирки с добавлением K₃ЭДТА. Все исследования проводили в день взятия крови. Обследовано 46 условно здоровых доноров (24 мужчины и 22 женщины) в возрасте 22–53 года (медиана — 36) и 43 больных РС (20 мужчин и 23 женщины) в возрасте 24–54 года (медиана — 39 лет). Достоверных различий по возрастному составу между группами не было (р=0,081).

Диагноз РС устанавливали согласно критериям МакДональда [18]. Тяжесть заболевания оценивали с помощью расширенной шкалы инвалидизации (EDSS), включающей балльную оценку состояния функциональных систем (зрительной, пирамидной, мозжечковой, чувствительной функций тазовых органов, ствола мозга) и нарушений ходьбы [13].

Подготовку образцов для проведения цитофлуориметрического учета проводили в соответствии с рекомендациями производителя антител (все антитела производства «Beckman Coulter», США). Для выявления основных популяций цитотоксических Т-клеток применяли следующую панель моноклональных антител, конъюгированных с различными флуорохромами: CD62L-ECD (клон DREG56, кат. № IM2713U), CD28-PC5.5 (клон CD28.2, кат. № B24027), CD27-PC7 (клон 1A4CD27, кат. № A54823), CD3-APC (клон UCHT1, кат. № IM2467), CD8-APC-Alexa Fluor 700 (клон B9.11, кат. № A66332), CD45RA-APC-Alexa Fluor 750 (клон 2H4LDH11LDB9 (2H4), кат. № A86050), CD4-Pacific Blue (клон 13B8.2, кат. № A82789), CD45-Krome Orange (клон J.33, кат. № A96416). Распределение антител по каналам флуоресценции проводили в соответствии с принципами формирования панелей для многоцветных цитофлуориметрических исследований, изложенных в литературе [4]. Удаление эритроцитов из образцов проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего раствора VersaLyse Lysing Solution (кат. № A09777), к 975 мкл которого ex tempore добавляли 25 мкл фиксирующего раствора IOTest 3 Fixative Solution (кат. № A07800). Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре «Navios™» («Beckman Coulter», США), оснащенном тремя диодными лазерами 405, 488 и 638 нм. Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи программ «Navios Software v.1.2» и «Kaluza™ v.1.2» («Beckman Coulter», США).

В рамках данного исследования использовали два основных алгоритма выявления субпопуляций Т-клеток, которые основываются на применении флуорохром-конъюгированных антител против CD27, CD28, CD45RA и CD62L [2]. Существенное различие между этими алгоритмами заключается в последовательности выделения целевых популяций или «тактике гейтирования» клеток. Первый подход (рис. 1, а-г) исходит из того, что основными маркерами или поверхностными антигенами, характеризующими уровень зрелости клеток, являются CD45RA и CD62L. На основании экспрессии этих двух антигенов выявляют следующие популяции Т-клеток периферической крови (рис. 1, а и б): «наивные» клетки с фенотипом CD45RA⁺CD62L⁺, клетки центральной и эффекторной памяти с фенотипами CD45RA^–CD62L⁺ и CD45RA^–CD62L^–, соответственно, а также «терминально-дифференцированные» CD45RA-позитивные клетки эффекторной памяти (CD45RA⁺CD62L^–). Дальнейший анализ состава цитотоксических Т-лимфоцитов с фенотипами CD45RA^–CD62L^– и CD45RA⁺CD62L^– строится на основании наличия или отсутствия костимуляционных молекул CD27 и CD28 [3]. CD3⁺CD8⁺ клетки эффекторной памяти подразделяются на четыре типа (рис. 1, в): ЕМ1, ЕМ2, ЕМ3 и ЕМ4, с фенотипами CD27⁺CD28⁺, CD27⁺CD28^–, CD27^–CD28^– и CD27^–CD28⁺, соответственно. Среди цитотоксических Т-клеток популяции TEMRA, исходя из уровня экспрессии CD27 и CD28, выделяют три субпопуляции (рис. 1, г): «пре-эффекторы» 1-го типа (pE1), ко-экспрессирующие CD27 и CD28 (pE2), «пре-эффекторы» 2-го типа, экспрессирующие только CD27, и «зрелые» эффекторы (E), не несущие обеих молекул на своей поверхности.

Второй подход (рис. 1, д-з) основан на первоначальном определении уровней CD27 и CD28 (рис. 1, д и ж), тогда как наличие CD45RA и/или CD62L является «вторичным» признаком и применяется для более детального анализа «не эффекторных» популяций Т-клеток (рис. 1, е и з) с фенотипом CD27⁺CD28⁺ [7]. В рамках последней группы клеток принято выделять «наивные» Т-клетки с фенотипом CD27⁺CD28⁺CD45RA⁺CD62L⁺ (рис. 1, е и з) для Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, соответственно), клетки центральной памяти с фенотипом CD27⁺CD28⁺CD45RA⁺CD62L^–, а также «транзиторные» клетки памяти (ТМ) с фенотипом CD27⁺CD28⁺CD45RA^–CD62L^–. В качестве наиболее зрелых эффекторных лимфоцитов периферической крови рассматриваются CD27^–CD28^– Т-клетки. Отдельного внимания заслуживает популяция клеток эффекторной памяти, так как в случае цитотоксических Т-клеток ее фенотип будет CD27⁺CD28^–, а в случае Т-хелперов — CD27^–CD28⁺ [2].

Статистическую обработку проводили при помощи программного обеспечения «Statistica 8.0» («StatSoft», США) и «GraphPad Prism 4.00» for Windows («GraphPad Prism Software Inc.», США). Нормальность распределения проверяли по критерию согласия Пирсона хи-квадрат. Результаты, полученные в ходе исследования относительного содержания субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток в периферической крови, приводили в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (Q₂₅ и Q₇₅). Для оценки достоверности различий использовали непараметрический критерий Манна —Уитни, корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции r Спирмена.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.