Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2016, № 2
|
Оригинальные статьи
|
Номер 2'2016
|
Иммуномодулятор трекрезан в лечении воспалительно-дегенеративных поражений мягких тканей пародонта
Е.В. Мокренко, П.Д. Шабанов
В модели воспалительно-дегенеративного поражения тканей пародонта крыс введением 2 %-ного водного раствора формальдегида (0,3 мл) в мягкие ткани пародонта оценивали оксидативный и иммунный статус. Показатели перекисного окисления липидов (содержание малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК) в сыворотке крови и тканях пародонта через 3 дня от начала воспаления были в 3,6–5,8 раза выше. Воспаление сопровождалось угнетением лимфокинпродуцирующей функции лимфоцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов с конканавалином А (КонА) на 39 % и с фитогемагглютинином (ФГА) на 37 %. Активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов снижалась на 13 %, что характерно для подострого течения воспалительного процесса. На фоне воспаления у крыс достоверно увеличивалось значение фагоцитарного числа на 26 % и показателя завершенности фагоцитоза — на 22 %, при снижении на 31 % числа нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе. Наряду с этим, показатели спонтанного НСТ-теста повышались на 63 %, а стимулированного — на 35 %. Трекрезан, вводимый внутрибрюшинно в течение 3 дней, снижал содержание МДА в крови на 61 %, ДК — на 68 %, увеличивал содержание восстановленного глутатиона в 2,9 раза и активность супероксиддисмутазы на 79 %. При этом наблюдали повышение лимфокинпродуцирующей функции лимфоцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов с КонА на 67 % и с ФГА — на 73 %. Фагоцитарная активность нейтрофилов увеличивалась на 24 %. Фагоцитарное число, равное среднему числу микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом, и показатель завершенности фагоцитоза снижались на 26 и 14 %, соответственно. Введение трекрезана внутрь оказывало сходное, но менее выраженное действие. Предварительное введение в желудок лидокаина с целью блокады желудочных афферентов, существенно не меняло эффекты трекрезана. Следовательно, трекрезан оказывает как противовоспалительное, так и иммуностимулирующее действие, при этом эффект от введения препарата внутрь несколько ниже, чем при введении внутрибрюшинно, и не зависит от активации афферентов желудка. (Цитокины и воспаление. 2016. Т. 15. №2. С. 204–211.)
Ключевые слова: пародонт, воспаление, оксидативный стресс, иммунный статус, трекрезан, противовоспалительное и иммуностимулирующее действие.
В настоящее время фармакология располагает достаточно большим арсеналом иммуномодулирующих средств, применяемых при различных видах патологии, включая воспалительный процесс. Новый отечественный препарат трекрезан — триэтаноламмониевая соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты — представляет собой высокоэффективное фармакологическое средство с адаптогенным и иммуностимулирующим действием. Трекрезан относится к малотоксичным соединениям (IV класс токсичности) с ЛД50 > 2,5 г/кг у мышей и > 6,5 г/кг у крыс. Он оказывает стресспротекторное действие в моделях иммобилизационного и болевого гиподинамического стресса, ускоряет репарацию поврежденных тканей (печень, миокард, мышцы), защищает внутренние органы от повреждающего действия токсинов, СВЧ-облучения, инфекционного фактора, обладает антиоксидантной активностью [16, 17]. Экспериментальными и клиническими исследованиями доказано, что фармакодинамические эффекты трекрезана сводятся, в основном, к следующим видам активности: 1) адаптогенная, 2) иммуностимулирующая, 3) энергостабилизирующая (антиастеническая), 4) противовоспалительная, 5) антиоксидантная, 6) антитоксическая [16]. Учитывая, что большинство экспериментов с трекрезаном выполнено при его введении внутрибрюшинно, а по инструкции препарат вводится внутрь, а также то, что трекрезан представляет собой триэтаноламмониевую соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты (в молекуле значимы ионные и водородные связи), возникает вопрос, действует ли сама молекула трекрезана или ее компоненты, поскольку в водных средах трекрезан должен диссоциировать. С другой стороны, иммуномодуляторы применяются во всех областях медицины, включая стоматологию, хотя в последней весьма осторожно, что связано с недостаточностью экспериментальных данных, подтверждающих эффективность иммуномодуляторов в стоматологической практике. В этом случае особенно важна оценка как местных изменений тканей пародонта, так и системных отклонений в функциях организма, на которые, как правило, обращают меньшее внимание [7, 8].
Целью исследования была оценка противовоспалительного и иммуностимулирующего действия трекрезана, вводимого различными путями в организм (внутрь и внутрибрюшинно), в экспериментальной модели воспалительно-дегенеративных нарушений тканей пародонта у грызунов (крыс).
Материалы и методы
Животные и модель. Опыты выполнены на 79 крысах самцах Вистар массой 220–250 г. С целью воспроизведения воспалительно-дегенеративных повреждений мягких тканей пародонта крысам, наркотизированным эфиром, в наружную часть десны на уровне нижних коренных зубов вводили по 0,15 мл с каждой стороны 2 %-ного водного раствор формальдегида (общий объем вводимого раствора составил 0,3 мл). Инъекции производили однократно. Контрольные животные получали инъекции 0,9 %-ного раствора натрия хлорида (физиологического раствора) в тех же объемах. Уже через сутки на месте введения формалина развивались стойкие обширные воспалительно-дегенеративные изменения мягких тканей пародонта, которые сохранялись до 2 недель. Помимо измененных тканей пародонта воспаление развивалось и на внутренней части щек, поскольку у крыс щеки небольшие, тонкие, в норме их внутренняя поверхность гладкая, в ней находятся протоки слюнных желез. Внешне облик крысы изменялся. Из-за отека мягких тканей щек обычная вытянутая форма морды животного изменялась, щеки раздувались, и животное становилось похожим на хомяка. Такой вид животных сохранялся обычно 3–4 дня, постепенно отек мягких тканей уменьшался. В отдельных случаях (приблизительно у 10 % животных) наблюдали абсцедирование процесса, тогда отечность мягких тканей сохранялась более длительно [8, 18].
Дизайн исследования. Для лечения воспалительно-дегенеративных поражений мягких тканей пародонта использовали субстанцию трекрезана (ОАО «Усолье-Сибирский ХФЗ», Иркутская область), вводимую в дозе 50 мг/кг в течение 3 дней подряд внутрибрюшинно (в/б) или внутрь (внутрижелудочно с помощью зонда). В отдельной серии исследований использовали предварительное введение лидокаина 1 % раствора 0,3 мл внутрижелудочно за 10 мин до введения трекрезана внутрь. Формировали следующие группы: 1) контроль 1 (интактные); 2) воспаление + физиологический раствор (контроль 2); 3) воспаление + трекрезан в/б; 4) воспаление + трекрезан внутрь; 5) воспаление + лидокаин + трекрезан внутрь.
После окончания всех опытов животных умерщвляли декапитацией, в крови биохимически определяли содержание малонового диальдегида (МДА) и ДК (перекисное окисление липидов), а также оценивали активность антиоксидантных систем (содержание восстановленного глутатиона и активность супероксиддисмутазы (СОД)). Кроме того, в крови исследовали показатели иммунного статуса. Для изучения клеточного звена иммунитета использовали реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) с митогенами. В качестве митогенов применяли фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (КонА). Состояние механизмов неспецифической защиты организма оценивали по показателям фагоцитоза, лизосомально-катионного теста (ЛКТ), теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).
Методы определения продуктов перекисного окисления липидов.Содержание ТБК-связывающих продуктов в пересчете на концентрацию малонового диальдегида определяли после приготовления 10 %-ных гомогенатов больших полушарий мозга в 25 мМ Трис-НСl буфере с 175 мМ КСl (рН 7,4) и осаждения в них белка [13].
Метод определения МДА основан на образовании в результате реакции тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом при высокой температуре в кислой среде окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532 нм. Количество комплекса, определяемого спектрофотометрически, пропорционально концентрации МДА в пробе.
Концентрации ДК определяли, используя методы [15] в модификации [6]. Принцип метода основан на свойствах сопряженных двойных и тройных связей в молекулах полиненасыщенных жирных кислот в ходе перекисного окисления на стадии образования свободных радикалов интенсивно поглощать в ультрафиолетовой области с характерными максимумами. ДК экстрагировали из навески ткани мозга массой 100 мг смесью гептана и изопропанола в соотношении 1:1 в объеме 2 мл. После добавления 0,2 мл воды и расслоения фаз, отбирали 0,5 мл верхнего гептанового слоя, к которому добавляли 2 мл 95 % этанола. Затем пробы фотометрировали. Поглощение при длине волны 233 нм обусловлено содержанием ДК.
Методы определения антиоксидантных систем.Активность СОД оценивали по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия в присутствии феназинметасульфата и восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) по методу [1]. Изменения оптической плотности проб регистрировали при длине волны 535 нм.
Содержание восстановленного глутатиона определяли по методу [13]. Принцип метода основан на реакции глутатиона с избытком аллоксана с образованием соединения с максимумом поглощения при длине волны 305 нм. Концентрация этого соединения прямо пропорциональна концентрации восстановленного глутатиона в пробе.
Методы определения показателей энергетического обмена.Содержание молочной и пировиноградной кислот определяли в крови энзиматическим методом [19] в модификации [2].
Методы иммунологических исследований. Иммунологические исследования проводили, руководствуясь методическими материалами по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств [10].
Реакция торможения миграции лейкоцитов. РТМЛ с митогенами характеризует функциональное состояние Т-лимфоцитов. РТМЛ основана на способности сенсибилизированных Т-лимфоцитов в специфических реакциях с антигеном in vitro выделять биологически активные субстанции или лимфокины, в том числе факторы, ингибирующие миграцию лейкоцитов. РТМЛ выполняли в капиллярах по [12]. Результаты реакции выражали в виде индекса миграции (ИМ) или как процент миграции: ИМ = длина зоны миграции в присутствии митогена / длина зоны миграции в контроле.
Определение фагоцитарной реакции нейтрофилов крови. Уровень нейтрофильного фагоцитоза по отношению к микробной тест-культуре изучали по [10]. Поглотительную способность фагоцитов оценивали по фагоцитарному показателю (ФП) — проценту фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов, фагоцитарному числу (ФЧ) — среднему числу микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом. Для оценки переваривающей функции определяли показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ), т. е. отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов (переваренных и непереваренных), выраженное в процентах: ПЗФ = общее количество переваренных микробов ´ 100 % / общее количество поглощенных микробов.
Лизосомально-катионный тест. Степень активности кислороднезависимых микробицидных систем фагоцита оценивали с помощью лизосомально-катионного теста (ЛКТ) [12]. Принцип метода основан на цитохимическом выявлении неферментных лизосомальных катионных белков, относительное содержание которых в исследуемых клетках позволяет судить о представительстве указанных антимикробных систем. Внутриклеточное содержание катионных белков крови оценивали по величине среднего цитохимического коэффициента (СЦК), вычисляемого по формуле: СЦК = (3а + 2б + 1,5в + 1г + 0,5д + 0е) / 100, где а–е — количество однотипных клеток с определенной степенью окрашиваемости цитоплазмы прочным зеленым, а цифры показывают степень выраженности и интенсивности окрашивания.
Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ). Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан под влиянием супероксид-аниона, образующегося в НАДФН-оксидазной реакции. Отложение сине-фиолетовых гранул диформазана в фагоцитирующей клетке соответствует локализации НАДФН-оксидазы. При этом размеры диформазановых отложений являются показателем суммарной активности НАДФН-оксидазы, инициирующей процесс стимуляции фагоцита. НСТ-тест, таким образом, интегрально характеризует кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцита, степень активации глюкозомонофосфатного шунта и связанное с ним образование свободных радикалов кислорода [4, 5]. В НСТ-тесте, в отличие от большинства цитохимических реакций, исследуют живые клетки, которые фиксируют лишь после инкубации с гистохимическим индикатором респираторного взрыва — нитросиним тетразолием. Это выполняется без дополнительной стимуляции (спонтанный НСТ-тест) или при стимуляции нейтрофилов in vitro (индуцированный или стимулированный НСТ-тест). Спонтанный НСТ-тест отражает степень функциональной активации клеток in vivo, индуцированный — функциональный резерв клетки и позволяет судить о дефектах бактерицидной системы фагоцитов [3]. Постановку НСТ-теста воспроизводили по методике, описанной в работе [11]. Индекс активации нейтрофилов рассчитывали по формуле: ИАН = (А × 0 + В × 1 + С × 2 + D × 3) / 100, где А — количество клеток, не содержащих диформазановых отложений или содержащих их в виде пылевидных немногочисленных включений; В — количество клеток, в которых площадь отложений диформазана не превышает 1/3 площади ядра; С — количество клеток, в которых отложения диформазана занимают от 1/3 до всей величины площади ядра; D — количество клеток с диформазановыми отложениями, по площади превосходящими площадь ядра.
Статистическая обработка результатов исследования. Выборка для каждой группы животных составила не менее 10 крыс. Математическую обработку результатов исследования проводили на компьютере с использованием стандартного пакета программ «Statistica» for Windows по общеизвестным методам вариационной статистики с оценкой статистической значимости показателей и различий рассматриваемых выборок по критерию Стьюдента. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне значимости 95 % (р<0,05). В тексте, таблицах результаты экспериментов представлены в виде M ± m, где: М — среднее арифметическое, m — среднеквадратичная ошибка среднего арифметического, n – число животных в группах.
Результаты и обсуждение
Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Начата подписка на 2016 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
