Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2016, № 2
|
Оригинальные статьи
|
Номер 2'2016
|
Новая лекарственная форма интерферона гамма для лечения патологий костной ткани
Е.Д. Даниленко, О.С. Иванова, Л.Р. Лебедев, Е.А. Волосникова, Е.И. Рябчикова, Е.В. Зонов, М.П. Богрянцева, Г.М. Левагина
Целью работы являлось получение и исследование свойств молекулярной конструкции, содержащей аналог IFNγ как противоопухолевый и антирезорбтивный агент и алендроновую кислоту в качестве векторной молекулы для адресной доставки конструкции в область костных метастазов. Электронно-микроскопическое изучение показало, что основным компонентом препарата являются наночастицы округлой формы размером 10–20 и 20–55 нм, различающиеся по связыванию с контрастирующими веществами. В результате исследования, проведенного с использованием хроматографических и электрофоретических методов, установлено, что конъюгирование IFNγ с декстраном и алендроновой кислотой и включение в состав конструкции не приводили к серьезным нарушениям структурно-конформационных свойств белка, о чем свидетельствует сохранение его молекулярной массы, способности к образованию димеров, протеолитической устойчивости. По уровню специфической противовирусной активности, определенной на культуре клеток MRC-5, цитокин в составе конструкции не отличался существенно от исходного IFNγ. Конструкция, несущая IFNγ и алендроновую кислоту, обладала более высоким сродством к гидроксилапатиту, аналогу минерального матрикса кости, чем IFNγ, что позволяет говорить о возможности накопления белка в костной ткани, что необходимо для реализации его эффектов в отношении костных метастазов. (Цитокины и воспаление. 2016. Т. 15. № 2. С. 154–160.).
Ключевые слова: интерферон гамма, алендроновая кислота, молекулярная конструкция.
Способность злокачественных новообразований к метастазированию является одной из серьезных проблем онкологической практики. Метастазы в кости скелета, прежде всего, в позвоночник, регистрируют на поздних стадиях развития рака молочной и предстательной желез, легких, почек и ряда других злокачественных новообразований [9, 12]. Рост скелетных метастазов вызывает разрушение костной ткани, переломы, развитие болевого синдрома, ухудшение качества жизни пациентов и их инвалидизацию [8].
Интерферон гамма (IFNγ) — природный цитокин, один из ключевых факторов регуляции иммунного ответа, прежде всего, его Т-клеточного звена [2]. Помимо иммуномодулирующей активности, известны противоопухолевые свойства белка, такие как способность усиливать активность цитотоксических лимфоцитов, подавлять рост опухолевых клеток, ингибировать ангиогенез [6]. С другой стороны, показано, что IFNγ принимает участие в регуляции процессов ремоделирования костной ткани, усиливает дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты, является ингибитором остеокластогенеза [10, 14]. В связи с этим понятен интерес исследователей к этому белку как потенциальному противоопухолевому средству лечения костных метастазов.
Одной из главных проблем терапии метастазов в костную ткань является способ эффективной доставки лекарственных веществ в опухоль. В настоящее время разработаны различные стратегии получения препаратов адресного действия и средств доставки лекарств, в том числе, в виде липосом, биодеградируемых полимерных каркасов, дендримеров, мицелл, гидрогелей, вирусоподобных частиц [3, 13, 15]. В ГНЦ ВБ «Вектор» был предложен дизайн оригинальной системы для депонирования и транспортировки белков, которая представляет собой молекулярную конструкцию, содержащую в центральной части дрожжевую двуспиральную РНК (дсРНК), защищенную оболочкой из конъюгата декстран-спермидин [3, 11]. Введение в ядро конструкции дсРНК, с одной стороны, позволяет решить задачу самосборки частицы, а с другой — потенцировать активность белкового компонента за счет противоопухолевой и иммуномодулирующей активности полинуклеотидного комплекса. Достоинством данной молекулярной конструкции является возможность введения в полисахаридную оболочку дополнительных факторов тропности.
В качестве одного из таких перспективных «нацеливающих» веществ для доставки лекарства в костную ткань можно рассматривать бифосфонаты (бисфосфонаты). Бифосфонаты — производные фосфоновых кислот, синтетические аналоги эндогенных пирофосфатов, участвующих в остеогенезе. Доказанным свойством бифосфонатов является быстрое и массированное накопление в кости (около 55 % от введенной дозы после однократного внутривенного введения), что связано с их способностью связываться с высокой аффинностью с кальцием минерального матрикса [7].
Целью данной работы являлось получение и исследование свойств конструкции, несущей на своей поверхности рекомбинантный IFNγ человека и аминобифосфонат — алендроновую кислоту (АЛН), — прототипа лекарственного препарата для терапии костных метастазов.
Материалы и методы
В работе использовали рекомбинантный аналог IFNγ человека Дельтаферон, отличающийся от нативного белка делецией 10 аминокислотных остатков на С-конце молекулы и заменой кластера KRKR на KGSA [5], с концентрацией белка 1,02 мг/мл и специфической активностью 2×106 МЕ/мг; препарат натриевой соли двуспиральной рибонуклеиновой кислоты, полученный из киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae по методу [1]; АЛН («TCI», Япония); декстран 40000 Да («AppliChem», США); натрия боргидрид («Sigma», США); натрия периодат («Sigma-Aldrich», США); спермидин («MP Biomedicals»); сорбенты для хроматографии (сефадекс G-25 («Pharmacia», Швеция); сефакрил S-200 («GE Healthcare», Швеция); реактивы для электрофореза (акриламид («Gerbu», Германия); агароза («Bio-Rad Laboratories Inc.», США); красители; маркеры молекулярных масс; соли, кислоты квалификации не ниже «х.ч.».
В качестве базисной при отработке методов синтеза конъюгата декстрана с аналогом рекомбинантного IFNγ человека Дельтафероном, АЛН и спермидином использовали методику, ранее разработанную для получения конъюгата декстрана с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа (TNFα) человека и спермидином [3]. Молекулярную конструкцию получали методом самосборки, для чего синтезированные конъюгаты смешивали с препаратом дсРНК и инкубировали при температуре (6±2) °С.
Для характеристики конъюгатов декстрана с IFNγ, АЛН и спермидином использовали метод вертикального гель-электрофореза в 15 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием красителем «Кумасси R-250». Способность конъюгатов к взаимодействию с дсРНК с образованием конструкций оценивали электрофорезом в 1 %-ном геле агарозы с визуализацией нуклеиновых кислот бромистым этидием.
Электронно-микроскопическое исследование образцов молекулярных конструкций проводили с помощью просвечивающего электронного микроскопа «Jem-1400» («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Анализируемый препарат разводили в 10 раз водой miliQ, сорбировали на медную сетку, покрытую формваровой пленкой с напылением углеродом, в течение 1 мин. Излишки жидкости отбирали фильтровальной бумагой, сетки контрастировали 2 %-м раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты или 0,5 %-м раствором уранилацетата в течение 10 с. Измерения объектов проводили непосредственно на мониторе цифровой камеры с помощью программы «iTEM», версия 5.2 («Olympus Soft Imaging Solutions», Германия).
Молекулярную массу IFNγ в конъюгате с декстраном и конструкции определяли методом электрофореза в 12 %-ном ПААГ в денатурирующих редуцирующих и нередуцирующих условиях, а также гель-хроматографией на колонке с Сефакрилом S200, используя белки-маркеры молекулярных масс (лизоцим — 14400 Да, яичный альбумин — 45000 Да, бычий сывороточный альбумин, БСА — 68000 Да) [4].
Для оценки устойчивости IFNγ в составе конструкции к действию трипсина в раствор исследуемого образца, содержащего белок в количестве 10 мкг, вносили свежеприготовленный раствор трипсина с активностью 26,8 е.а./г в количествах 0,3 и 1 мкг, из расчета трипсин : белок — 1:10 и 1:30 (по массе). По завершении инкубации (при 20–25 °С в течение 10 мин) добавляли «стоп-раствор» (додецилсульфат натрия, 2-меркаптоэтанол и бромфеноловый синий в 20 %-ом растворе глицерина). После прогревания (5 мин при 90 °С) продукты реакции анализировали электрофорезом в 12 %-м ПААГ.
Связывание конъюгатов и конструкций, содержащих IFNγ и АЛН,с гидроксилапатитом (ГАП) оценивали методом хроматографии, как описано в[4]. Десорбцию проводили линейным градиентом хлорида натрия от 0,1 до 1,5 М. Для анализа хроматографических фракций использовали метод электрофореза в 15 %-м ПААГ.
Определение специфической активности IFNγ в составе конъюгатаи конструкции проводили микрометодом в культуре диплоидных клеток MRC-5 по подавлению цитопатического действия тест-вируса энцефаломиелокардита, штамм Колумбия, в дозе 100 ЦПД50 относительно референс-препарата Interferon-g Human Recombinant expressed in E. coli, Саt. №13265, «Sigma».
Результаты и обсуждение
Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Начата подписка на 2016 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
