197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2016, № 2

CCR6-позитивные Т-хелперы периферической крови при рассеянном склерозе

И.В. Кудрявцев, А.Г. Ильвес, А.Г. Борисов, К.К. Минеев, А.М. Петров, А.А Савченко, М.К. Серебрякова, И.Д. Столяров

С применением многоцветного цитометрического анализа проведено исследование экспрессии хемокиновых рецепторов (CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5) на Т-хелперах (Th) различного уровня дифференцировки, выявленных на основании CD45RA и CD62L, в группе условно здоровых доноров (n=50) и больных рассеянным склерозом (n=36). Среди CXCR5– Th были выявлены три субпопуляции клеток, содержащих в своем составе Th17: CXCR3–CCR6+CCR4- (Th17), CXCR3–CCR6+CCR4+ (Th17 и Th22) и CXCR3+CCR6+CCR4– (Th1/Th17). Относительное содержание Th с фенотипом CXCR3–CCR6+CCR4+ у больных было повышено (р=0,004), а Th1/Th17 — существенно снижено р<0,001) при сравнении с группой контроля. Содержание CCR6+ Th17 достоверно не отличалось от группы контроля в рамках Th с фенотипами CD45RA–CD62L+ и CD45RA–CD62L–, снижение уровня этих клеток в циркуляции у больных РС коррелировало с увеличением инвалидизации (r=–0,474 при р=0,003 и r=–0,489 при р=0,002, соответственно). Уровень Th17, коэкспрессировавших CCR6 и CCR4, был повышен у больных РС в рамках указанных выше субпопуляций Th (р=0,011 и р=0,003, соответственно), но не коррелировал с баллами EDSS. Относительное содержание Th1/Th17 с фенотипом CD45RA–CD62L+ и CD45RA–CD62L– у больных РС было снижено почти в два (р<0,001) и три (р<0,001) раза по сравнению с группой контроля, соответственно. Проведение дискриминантного анализа и ROC-анализа показало высокую значимость определения уровня Th1/Th17 с фенотипом CD45RA–CD62L– в периферической крови для клинической лабораторной диагностики. (Цитокины и воспаление. 2016. Т. 15. № 2. С. 166–172.)

Ключевые слова: проточная цитометрия, рассеянный склероз, Т-хелперы 17, CXCR3+CCR6+CCR4–, Th1/Th17.

Рассеянный склероз (РС) – тяжелое заболевание центральной нервной системы, в развитии которого одну из ключевых ролей играют иммунопатологические процессы [4]. Долгое время считалось, что ведущую роль в патогенезе РС играют Т-хелперы 1-го типа (Th1), способные к продукции IFNγ, однако в последние годы появляется все больше работ, посвященных исследованию другой субпопуляции Т-клеток — Т-хелперов 17 (Th17), рассматриваемых в качестве одних из самых перспективных мишеней для терапии РС [17]. Th17 являются весьма гетерогенной популяцией клеток периферической крови. Помимо способности к продукции цитокинов семейства IL-17, они экспрессируют на своей поверхности хемокиновый рецептор CCR6 [5]. Кроме CCR6 на мембране Th17 может присутствовать еще один хемокиновый рецептор — CXCR3. Это позволяет выявить клетки, способные к одновременной продукции IFNγ и IL-17, что является поводом для обозначения этой популяции как Th1/Th17. Большинство функциональных характеристик, свойственных Th17 (синтез IL-17A, экспрессия мРНК транскрипционного фактора, гомологичного RORγt мыши, и т. д.), присуще также клеткам с фенотипом CCR6⁺CCR4⁺.

Особый интерес при исследовании клиники РС представляет тот факт, что дифференцировка Th17 у человека находится под контролем таких провоспалительных цитокинов, как IL-1β и IL-6 [5]. Уровень экспрессии этих цитокинов клетками, равно как и их содержание в сыворотке крови и спинно-мозговой жидкости больных РС, тесно связаны с тяжестью заболевания и его прогрессированием, что может рассматриваться в качестве одного из факторов дифференцировки Т-хелперов в Th17 [14]. С другой стороны, столь же существенную роль в формировании пула эффекторных Th17 играет IL-23, сывороточные концентрации которого у больных РС существенно превосходят таковые у условно здоровых доноров [8, 15]. С другой стороны, эффекторными цитокинами лимфоцитов данной популяции являются IL-17A, IL-17F и IL-22, роль которых в патогенезе РС (в силу их высокой концентрации у больных) обсуждается уже длительное время [7]. Поэтому исследование Th17 при РС и, особенно, отдельных их субпопуляций представляется весьма актуальным как с точки зрения анализа причин возникновения данного заболевания, так и изучения механизмов его развития.

Материалы и методы

Объектом исследования служила венозная кровь условно здоровых доноров (n=50) и больных РС (n=36), полученная путем пункции кубитальной вены и собранная в вакуумные пробирки с содержанием K₃ЭДТА. Группы больных РС и условно здоровых доноров достоверно не различались по половому и возрастному составу. Диагноз РС устанавливали согласно критериям МакДональда [13]. Тяжесть заболевания оценивали с помощью расширенной шкалы инвалидизации (EDSS), включающей балльную оценку состояния функциональных систем (зрительной, пирамидной, мозжечковой, чувствительной, функций тазовых органов, ствола мозга) и нарушений ходьбы [10].

Все исследования проводили в день взятия крови. Подготовку образцов периферической крови и настройку проточного цитофлуориметра проводили в соответствии с рекомендациями производителей антител. Для выявления Т-хелперов использовали антитела против CD3 (клон UCHT1) и CD4 (клон 13B8.2), для разделения CD3⁺CD4⁺ лимфоцитов на отдельные субпопуляции использовали антитела против CD45RA (клон 2H4LDH11LDB9 (2H4)) и CD62L (клон DREG56) («Beckman Coulter», США). Субпопуляция «наивных» (N) Т-хелперов обладала фенотипом CD45RA⁺CD62L⁺, клетки с фенотипами CD45RA^–CD62L⁺ и CD45RA^–CD62L^– соответствовали Т-хелперам центральной (СМ) и эффекторной (ЕМ) памяти, а «терминально-дифференцированные» CD45RA-позитивные эффекторные Т-хелперы (TEMRA) определяли как CD45RA⁺CD62L^–, как это было описано ранее [3]. На всех указанных выше субпопуляциях CD3⁺CD4⁺ лимфоцитов, находящихся на разных стадиях дифференцировки, при помощи моноклональных антител анализировали уровень экспрессии следующих хемокиновых рецепторов: CCR4 (CD194, клон L291H4), CCR6 (CD196, клон G034E3), CXCR3 (CD183, клон G025H7) и CXCR5 (CD185, клон J252D4) («Biolegend», США). Подбор оптимальных комбинаций антител и конъюгированных с ними флуорохромов производили на основании принципов, изложенных ранее [2]. Удаление эритроцитов из образцов проводили с использованием лизирующего раствора VersaLyse («Beckman Coulter», США), к 975 мкл которого ex tempore добавляли 25 мкл фиксирующего раствора IOTest 3 Fixative Solution («Beckman Coulter», США). После разрушения эритроцитов образцы однократно отмывали избытком физиологического раствора при 330 g в течение 7 мин, после чего надосадок удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в физиологическом растворе с рН 7,2–7,4, содержащем 2 % параформальдегида («Sigma-Aldrich», США). Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре Navios™ («Beckman Coulter», США), оснащенном тремя диодными лазерами 405, 488 и 638 нм. Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи программ «Navios Software v.1.2» и «Kaluza™ v.1.3» («Beckman Coulter», США). Статистическую обработку проводили при помощи программного обеспечения «Statistica 8.0» («StatSoft», США) и «GraphPad Prism 4.00 for Windows» («GraphPad Prism Software Inc.», США). Нормальность распределения проверяли по критерию согласия Пирсона хи-квадрат. Результаты выражали в виде % позитивных клеток от искомой популяции, приводили в виде медианы и интерквартильного размаха (25%; 75%). Для оценки достоверности различий использовали непараметрический U-критерий Манна — Уитни, для исследования силы взаимосвязей показателей вычисляли коэффициент ранговой корреляции по Спирмену. Дискриминантный анализ проводили по методу Forward stepwise (Tolerance = 0,010, F to enter = 2,41, F to remove = 0,00). Количество заданных шагов соответствовало количеству классифицируемых показателей. Также определяли линейные дискриминантные функции и их переменные. Для исследования значимости изменения относительного содержания различных клеточных субпопуляций периферической крови в клинической практике и выбора значения оптимальных параметров для разделения групп больных РС и условно здоровых доноров проводили анализ кривых операционной характеристики (ROC-анализ) и вычисляли площадь под кривой операционной характеристики (AUC).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Начата подписка на 2016 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.