197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12,
Институт экспериментальной медицины РАМН
Тел.: (812) 543 52 14, +7 921 984 11 30, +7 921 909 55 49
Факс: (812) 543 52 14
E-mail:
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья

Журнал 'Цитокины и воспаление', 2017, № 3

Прогностическое значение лейкоцитмодулирующей активности сыворотки крови у детей с болезнью Крона

В.И. Ашкинази, Е.И. Крестова, Н.Ю. Широкова, М.Ю. Лебедев, Э.Н. Федулова, О.А. Тутина

Цель исследования: оценить прогностическое значение лейкоцитмодулирующей активности (ЛМА) сыворотки крови у детей с болезнью Крона (БК) и ее взаимосвязь с некоторыми про- и противовоспа-лительными факторами, оказывающими влияние на ее величину. Материалы и методы: обследованы 57 пациентов в возрасте 5–17 лет, страдавших БК. Содержание неоптерина, растворимых молекул адгезии (sP-селектина и sPECAM-1), маннансвязывающего лектина (МСЛ), эластазы нейтрофилов, цитокинов оценивали с помощью ИФА. Кислородзависимый метаболизм нейтрофилов изучали с использованием люминолзависимой хемилюминесценции. Результаты: максимальные показатели ЛМА у обследованных детей наблюдались в период обострения заболевания, что подтверждалось результатами эндоскопии кишечника. Зарегистрирована взаимосвязь ЛМА с концентрацией sP-селектина, неоптерина, МСЛ, эластазы нейтрофилов, IL-1β, TNFα, TGFβ, IL-10, величиной спонтанной продукции кислородных радикалов. Заключение: установлена зависимость величины ЛМА сыворотки крови от периода заболевания, что дает основания использовать этот показатель для прогноза обострения болезни и своевременного начала терапии. Зарегистрированы факторы, оказывающие влияние на ЛМА сыворотки крови у детей с БК, что подтверждалось выявленными корреляционными связями с изученными про- и противовоспалительными факторами (Цитокины и воспаление. 2017. Т. 16. № 1. С. 5–10).

Ключевые слова: болезнь Крона, лейкоцитмодулирующая активность сыворотки крови, про- и противовоспалительные факторы.

Болезнь Крона (БК) — хроническое рецидивирующее заболевание, возникающее у генетически предрасположенных детей и взрослых вследствие неадекватных реакций врожденного и адаптивного иммунитета на нормальную микрофлору кишечника.Ключевую роль при БК играют Т-лимфоциты, прежде всего CD4⁺Т-клетки (Т-хелперы, Th) — доминирующая субпопуляция воспалительного процесса, а также несущие противовоспалительную функцию регуляторные Т-клетки (Тreg), которые блокируют Т-эффекторы, поддерживая тем самым иммунный гомеостаз [4].

Определяющим типом иммунного ответа при этом заболевании считается Th1-опосредованный ответ, связанный с повышенной продукцией интерферона γ (IFNγ), интерлейкинов IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, IL-18, фактора некроза опухоли альфа (TNFα), растворимых молекул межклеточной адгезии и других факторов [12]. Кроме того, слизистая оболочка у больных с БК массивно инфильтрирована еще одной популяцией CD4⁺Т-лимфоцитов – Th17-клетками, активно секретирующими IL-17А, IL-17F, IL-21, IL-23, IL-6, TNFα [13, 14]. Иммунорегуляторная функция Тreg у таких пациентов в первую очередь связана с продукцией трансформирующего фактора роста β (TGFβ) и IL-10, а также с IL-11, IL-22, IL-35, что способствует торможению аутоиммунных реакций и формированию толерантности к собственным антигенам [4].

Известно, что наряду с Т-лимфоцитами в реализации воспаления участвуют многие клетки организма (нейтрофилы, макрофаги, эозинофилы, В-лимфоциты, тромбоциты, тучные клетки, фибробласты, эндотелиоциты и др.), а также секретируемые ими разнообразные факторы (модуляторы) воспаления (лейкотриены, тромбоксаны, простагландины, биогенные амины, эндогенные белки и пептиды, цитокины, факторы роста, белки острой фазы, активные формы кислорода и т. д.). Вся совокупность этих факторов, возникающих как на этапах созревания клеток, так и образующихся в них только при активации воспалительного процесса, составляет воспалительный «потенциал», который формируется как локально, так и системно, активно проявляя себя в сыворотке крови. При этом оценить суммарный «вклад» всех сывороточных факторов в общую воспалительную реакцию необычайно сложно, поскольку у пациента в исследуемом субстрате содержание одних компонентов может быть повышено, а других — снижено. В связи с этим, в нашем исследовании, для комплексной оценки воспалительного процесса у детей с БК было использовано определение лейкоцитмодулирующей активности (ЛМА) сыворотки крови, что дает возможность зарегистрировать все ключевые события, возникающие в организме, и учитывать баланс как про-, так и противовоспалительных факторов [5]. В качестве детекторов при этом были использованы лейкоциты здоровых доноров (в первую очередь, полиморфноядерные), которые наиболее существенно меняют свою функциональную активность in vitro под влиянием всей суммы факторов, содержащихся в сыворотке крови. Информативность таких исследований для оценки активности и тяжести воспалительного процесса, в значительной мере определяющих прогноз течения заболевания, наблюдали при остром коронарном синдроме, флегмонах челюстно-лицевой области, при микст-инфекции клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза, муковисцидозе [3, 6–8].

Цель исследования: оценить прогностическое значение ЛМА сыворотки крови у детей с БК, и взаимосвязь с некоторыми про- и противовоспалительными факторами, оказывающими влияние на ее величину.

Материалы и методы

Обследованы 57 детей в возрасте 5–17 лет, страдавших БК. Диагноз ставили на основании комплексного обследования, включавшего в себя клинико-лабораторные данные, а также эндоскопическое исследование слизистой оболочки кишечника с морфологическим анализом биоптатов. У 35 пациентов на основании педиатрического индекса активности БК PСDAI (Pediatric Crohn's Disease Activity Index) было отмечено обострение заболевания, у 22 — клиническая ремиссия. Полученные данные сопоставляли с аналогичными показателями 20 условно здоровых детей того же возраста, которые составили контрольную группу. Все пациенты, участвовавшие в клинических исследованиях, дали добровольное информированное согласие на медицинское вмешательство и публикацию полученных данных. ЛМА сыворотки крови изучали с помощью реакции люминолзависимой хемилюминесценции с использованием лейковзвеси здоровых добровольцев на люминометре «Luminoskan Ascent» («Thermo Scientific», Швеция). Для этого 5 мл крови, полученной из локтевой вены доноров, стабилизировали гепарином (концентрация в крови — 10 ЕД/мл) и разводили равным объемом физиологического раствора. Затем, с целью осаждения эритроцитов, в центрифужные пробирки вносили 4 мл разведенной крови и 1,75 мл 3,42 %-ного раствора декстрана Т-500 и выдерживали при комнатной температуре 90–120 мин. Полученную лейковзвесь (надосадок) отбирали, дважды отмывали при 1500 об/мин (в течение 5 мин) и доводили раствором Хенкса без фенолового красного до концентрации 1×10⁶ кл./мл. После этого взвесь лейкоцитов в объеме 100 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета, добавляли 100 мкл люминола (10^{-3 М, «}Sigma») и инкубировали 15 минут при 37 °С в режиме автоматического встряхивания в микропланшетном люминометре для стабилизации реакции. Далее в лунки планшета с реакционной смесью последовательно добавляли 50 мкл сыворотки больного (индуцированная реакция), и 50 мкл раствора Хенкса (спонтанная реакция) и продолжали инкубацию в люминометре в течение 60 мин. При этом, согласно заданной программе, прибор автоматически производил измерения каждые 2 мин. Под влиянием всей суммы факторов, содержавшихся в сыворотке больного, фагоциты здоровых доноров функционально перестраиваются (активируются) и образуют в результате дыхательного взрыва активные формы (радикалы) кислорода, которые окисляют люминофор – люминол. В результате выделяются кванты света, которые фиксируются прибором и выражаются в относительных световых единицах. Итоговая реакция при этом определяется нейтрофилами, поскольку все остальные лейкоциты окисляют люминол намного слабее. Чем выше активность исследуемой сыворотки крови, тем, соответственно, выше будут показатели хемилюминесценции в индуцированной реакции относительно спонтанной и наоборот. По результатам исследования рассчитывали индекс стимуляции (отношение максимальной величины индуцированной реакции к показателям спонтанной), который (в данном случае), согласно Д.Н. Маянскому и др., расценивали как показатель ЛМА сыворотки крови [5, 6].

Содержание неоптерина определяли при помощи набора «Neopterin ELISA» («IBL», Германия). Активность МСЛ изучали с использованием тест-системы «Human MBL ELISA» («Hycult biotech», Нидерланды). Концентрацию растворимых молекул адгезии – sP-селектина (soluble platelet selectin) и sPECAM-1 (soluble platelet–endothelial cell adhesion molecule1), TGFβ и эластазы лейкоцитов (нейтрофилов) оценивали с помощью наборов «Bender Medsystems», Австрия. Уровни цитокинов TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 исследовали с использованием тест-систем АО «Вектор-Бест», Россия. Респираторный метаболизм нейтрофилов в спонтанном (с раствором Хенкса) и индуцированном (с использованием опсонизированного зимозана) тестах исследовали на хемилюминометре «Luminoskan Ascent» («Thermo Scientific», Швеция) с последующим расчетом индекса стимуляции. Для оценки активности воспалительного процесса в кишечнике одновременно выполняли эндоскопию с использованием видеоколоноскопа «PENTAX» (EC-3830F) и морфометрию полученных биоптатов слизистой оболочки кишки с выделением клеток стромы и инфильтрата.

Обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Описательная статистика признака включала определение медианы (Ме) и интерквартильного размаха (Q25–Q75). При проверке гипотез использовали тест Манна — Уитни и корреляционный анализ по Спирмену (R). Статистическими значимыми считали различия между показателями при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья

Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.