E-mail: [email protected]
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'cytokines.ru', 2017, № 3

Влияние аргининдеиминазы S. pyogenes на пролиферативную и миграционную активность эндотелиальных клеток вены пупочного канатика человека

Дж.Т. Маммедова, Э.А. Старикова, Л.А. Бурова, А.Б. Малашичева, Д.С. Семёнова, И.С. Фрейдлин

Для изучения антиангиогенного потенциала аргининдеиминазы S. pyogenes проводили сравнение влияния S. pyogenes исходного штамма М49-16 и его изогенного мутанта с инактивированным геном аргининдеиминазы ArcA (S. pyogenes М49-16delArcA) на пролиферативную и миграционную активность эндотелиальных клеток HUVEC. Исследования показали, что супернатант разрушенных стрептококков исходного штамма в широком диапазоне концентраций достоверно подавлял пролиферативную и миграционную активность эндотелиальных клеток. Ингибирующее действие супернатанта разрушенных стрептококков изогенного мутанта с инактивированным геном аргининдеиминазы проявлялось только в максимальной исследуемой концентрации и было выражено достоверно слабее, чем действие супернатанта исходного штамма. Это доказывает, что аргининдеиминаза S. pyogenes, обладает антиангиогенным действием и подтверждает данные других исследователей, полученные с использованием гомологичных белков, выделенных из Mycoplasma spp. и Pseudomonas spp. (cytokines.ru. 2017. Т. 16. № 3. С. 48–51.)

Ключевые слова: аргининдеиминаза, S.

Аргининдеиминаза (АД) — бактериальный фермент, который катализирует гидролиз аргинина до цитруллина и аммиака. Активность АД приводит к созданию дефицита аргинина, условно-заменимой протеиногенной аминокислоты и предшественника для синтеза оксида азота, полиаминов, пролина и глутамата у млекопитающих [6]. В настоящее время установлено, что АД обладает способностью подавлять пролиферацию различных типов опухолевых клеток в культуре и противоопухолевым действием с минимально выраженными побочными эффектами [4, 5, 8]. Предполагают, что противоопухолевое действие АД связано не только со способностью ингибировать рост трансформированных клеток, но и с антиангиогенной активностью фермента [5, 6, 8]. В наших предыдущих исследованиях впервые было показано, что АД в составе супернатантов разрушенных стрептококков (СРС) S. pyogenes подавляла пролиферацию, миграцию и адгезию эндотелиальных клеток человека линии EA.hy926 [1, 2].

Цель данного исследования состояла в изучении действия АД S. pyogenes М49-16 на функции клеток вены пупочного канатика человека (HUVEC), связанные с ангиогенезом. Для этого проводили сравнение влияния на пролиферативную и миграционную активность HUVEC S. pyogenes исходного штамма М49-16 и его изогенного мутанта с инактивированным геном АД.

Материалы и методы

Для выделения эндотелиальных клеток из пуповинной вены человека за основу был взят протокол, опубликованный ранее [3]. Пуповины получали из перинатального центра ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова». С момента родов до выделения клеток проходило не более 48 ч. Вены промывали физиологическим раствором (ФР) (ООО «БиолоТ»), после чего один конец пережимали хирургическим зажимом, а в другой вводили раствор коллагеназы второго типа («Worthington») 140 ЕД/мл в среде DMEM. После введения раствора коллагеназы второй конец тоже пережимали, и пуповину погружали в нагретый до 37 °C ФР. Через десять минут раствор коллагеназы («Worthington») из вены собирали в 50 мл пробирки («BD Falcon»), вену еще раз промывали ФР. Полученную суспензию клеток осаждали центрифугированием при 300 g в течениe 5 мин. Осадок клеток ресуспендировали в среде «ECBM-2» («Endothelial Cell Basal Medium 2») («Promo cell») и высевали в культуральные флаконы («Nunc»), покрытые 0,2 % желатином. В экспериментах использовали культуры HUVEC 3–5 пассажа. Пересев клеток производили дважды в неделю. Дезинтеграцию монослоя вызывали инкубацией в растворе трипсина–версена («Sigma-Aldrich») при 37 °C.

В работе использовали штаммы S. pyogenes M49-16 и его изогенного мутанта S. pyogenes M49-16delArcA с инактивированным геном аргининдеиминазы ArcA, утратившего способность синтезировать АД, любезно предоставленные проф. А.Н. Суворовым (отд. молекулярной микробиологии, ФГБНУ «ИЭМ», Санкт-Петербург). СРС оригинального штамма S. pyogenes М49-16 и его изогенного мутанта с делецией гена АД (S. pyogenes М49-16delArcA), содержащие биологически активные внутриклеточные компоненты, были приготовлены как описано нами ранее [1]. СРС вносили в культуры в нетоксичном для клеток диапазоне концентраций.

Для анализа пролиферативной активности использовали метод, описанный ранее [1]. Клеточную суспензию вносили в 96-луночные планшеты («Sarstedt») по 5 тысяч клеток в 100 мкл полной культуральной среды «ECGM-2» («Promo cell»). Клетки инкубировали в присутствии CPС 72 ч при температуре 37 °С во влажной атмосфере с 5 % СО₂. Клетки фиксировали 10 мин в 50 мкл 0,2 % раствора кристаллического фиолетового («Sigma-Aldrich») на 10 % метаноле. По окончании инкубации избыток красителя удаляли трехкратной отмывкой дистиллированной водой. Экстракцию красителя производили 10 % уксусной кислотой. Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного спекрофотометра («Bio-Rad Laboratories») при длине волны 570 нм. Результат выражали в процентах, за 100 % принимали среднее значение оптической плотности в контрольных лунках.

Для анализа миграционной активности использовали модель «раны» [7]. Клеточную суспензию вносили в 96-луночные планшеты («Sarstedt») по 25 тысяч клеток в 100 мкл полной среды ECBM-2 («Promo cell»). Клетки инкубировали 24 ч при температуре 37 °С во влажной атмосфере с 5 % СО₂ до образования конфлюентного монослоя. После этого монослой частично разрушали пластиковым наконечником («рана») и проводили однократную отмывку 100 мкл полной культуральной среды. Далее в лунки вносили исследуемые вещества. Клетки инкубировали 24 ч при 37 °С во влажной атмосфере с 5 % СО₂. По окончании инкубации клетки фиксировали 10 мин в 50 мкл 0,2 % раствора кристаллического фиолетового («Sigma-Aldrich») на 10 % метаноле, избыток красителя удаляли трехкратной отмывкой дистиллированной водой. Размеры свободной от клеток площади оценивали с помощью программы «AxioVision Rel. 4.7» («Zeiss»). Результат выражали в процентах, за 100 % принимали среднее значение площади, свободной от клеток в контрольных лунках.

Анализ и обработку данных производили с помощью программы «Statistica 5.0» с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "cytokines.ru" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск cytokines.ru, 2008 год.