E-mail: [email protected]
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'cytokines.ru', 2017, № 3

Влияние ростовых факторов на актиновый цитоскелет клеток эпителия тимуса

К.В. Рутто, Дж.Т. Маммедова, Э.А. Старикова, Е.П. Киселева

Клетки эпителия тимуса принимают активное участие в позитивной и негативной селекции тимоцитов, однако многие механизмы презентации антигенов в тимусе остаются неясными, в частности, влияние на эпителий тимуса ростовых факторов. Целью исследования послужило изучение изменений актинового цитоскелета в клетках эпителия тимуса под влиянием семафорина 3А, фактора роста кератиноцитов (KGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF). Исследования проводили на двух линиях тимусного эпителия мышей — кортикального cTEC1-2 и медуллярного mTEC3-10. С помощью метода ОТ-ПЦР была выявлена экспрессия мРНК рецепторов этих факторов на клетках эпителия, а именно рецепторов PlexA1, PlexA3, Nrp-1 для взаимодействия с семафорином 3А, cMet — для взаимодействия с HGF и FGFR2IIIb — для связывания KGF. Изменения актинового цитоскелета были выявлены после инкубации клеток обеих линий в течение 2 ч с семафорином 3А, а влияние двух других факторов — KGF и HGF — было выражено только на клетках cTEC1-2. Полученные данные имеют существенное значение для лучшего понимания функционирования клеток эпителия и поддержания внутритимусного микроокружения для созревания тимоцитов. (cytokines.ru. 2017. Т. 16. № 3. С. 62–65.)

Ключевые слова: тимус, эпителиальные клетки, cTEC1-2, mTEC3-10, семафорин 3А, фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста гепатоцитов (HGF).

Тимус — центральный орган иммунной системы, в котором происходит созревание и дифференцировка Т-лимфоцитов. Ключевыми этапами этого процесса являются позитивная селекция в корковой зоне и негативная селекция тимоцитов, происходящая в мозговой зоне тимуса. В ходе этого процесса тимоциты контактируют с антиген-презентирующими клетками тимуса, которыми являются кортикальные и медуллярные эпителиальные клетки [6]. За последние годы в изучении процесса презентации антигенов в тимусе был достигнут существенный прогресс, и, в частности, с помощью прижизненного внутритканевого сканирования в реальном времени, получены новые данные о передвижении тимоцитов и их контактах с антиген-презентирующими клетками [10]. Однако детали их взаимодействия остаются неясными. Например, это касается участия в этих процессах ростовых факторов, таких как семафорин 3А, фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста кератиноцитов (KGF), синтезируемых стромальными клетками тимуса [2, 7, 9]. Известно, что семафорин 3А принимает участие в процессах адгезии/деадгезии тимоцитов человека к эпителиальным клеткам тимуса, но влияет при этом только на тимоциты, а KGF и HGF стимулируют пролиферацию тимусного эпителия [4, 7, 8]. Влияние этих факторов на цитоскелет эпителиальных клеток тимуса не изучалось.

Цель исследования — изучить влияние трех ростовых факторов: семафорина 3А, KGF и HGF на актиновый цитоскелет клеточных линий кортикального и медуллярного эпителия тимуса мыши.

Материалы и методы

Клеточные культуры. Работу проводили на двух линиях тимусного эпителия мышей – кортикального cTEC1-2 и медуллярного mTEC3-10, любезно предоставленных в наше распоряжение профессором M. Kasai из Токийского университета [5]. Первоначально клеточные линии были получены из тимусов новорожденных мышей линии C57BL/6 путем ферментной диссоциации и охарактеризованы по экспрессии цитокератинов с помощью иммуногистохимического метода. Клетки культивировали до образования монослоя в среде DMEM («Sigma», США) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone», UK), 0,1 мг/мл гентамицина («БиолоТ», Россия) и 0,6 мг/мл глутамина («Биолот», Россия) при 5 % CO₂ и 37 °С.

Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Для оценки уровня экспрессии мРНК рецепторов PlexA1, PlexA2, PlexA3, PlexA4, Nrp-1, c-Met, FGFR2IIIb в эпителиальных клетках тимуса мыши использовали полуколичественный метод ОТ-ПЦР. Клетки эпителия пересевали в 24-луночный планшет в количестве 3?10⁵ клеток на лунку на 24 ч до образования конфлюентного монослоя. Общую РНК выделяли одноступенчатым методом с помощью реактива TRI («Sigma», США) согласно инструкции производителя. Для оценки экспрессии мРНК рецепторов использовали следующие праймеры: для PlexA1 — прямой 5? actgcccagctgactcaccagc 3? и обратный 3? gggctgcaaagcaccttgccca 5? (размер продукта 202 п. н., 28 циклов); для PlexA2 — прямой 5? gaccatggtgaccagaaggagggtg 3? и обратный 3? tgccgcacatctgtgtcgtgga 5? (233 п. н., 34 цикла); для PlexA3 — прямой 5? cgtcacacctggaagagcaactgc 3? и обратный 3? atgtcctggtcactgatggatgcca 5? (284 п. н., 32 цикла); для PlexA4 – прямой 5? cagctccagtgtgcagtgtcag 3? и обратный 3? aaccaccggctctcatgggcag 5? (269 пары нуклеотидов, 28 циклов); для Nrp-1 — прямой 5? tggtctggatggtggttgggc 3? и обратный 3? aagagaggaaaaaagggggct 5? (865 п. н., 30 циклов); для c-Met — прямой 5? tgccagagacatgtacgataaag 3? и обратный 3? atggcaacagagaaggatatgg 5? (437 п н, 34 цикла); для FGFR2IIIb — прямой 5?ggagtttgtctgcaaggtttac 3? и обратный 3?ggttggcctgccctatataat 5? (230 п н, 34 цикла). В качестве гена сравнения был выбран ?-актин, для выявления мРНК которого использовали прямой праймер — 5? atggatgacgatatcgct 3? и обратный – 3? atgaggtagtctgtcaggt 5? (568 п н, 20 циклов). Результаты визуализировали по электрофорезу в 1,5 % геле, окрашенном бромистым этидием (ICN, США), с последующим фотографированием.

Анализ структуры актинового цитоскелета. Для оценки влияния ростовых факторов на цитоскелет клеток эпителия тимуса клетки cTEC 1-2 или mTEC 3–10 культивировали в количестве 2,2?10⁵ на покровных стеклах, которые помещали на дно 24-луночных планшетов. Монослой клеток инкубировали в течение 2 ч с добавлением одного из ростовых факторов, а именно: 10 нг/мл HGF («R&D», США), 100 нг/мл KGF («R&D», США) или 100 нг/мл семафорина 3А («R&D», США). По окончании инкубации клетки фиксировали в 50 мкл 4 % формальдегида 10 мин при 25 °С, после чего промывали 3 раза физиологическим раствором. Пермеабилизацию клеток проводили 0,01 % раствором тритона Х-100 («Sigma», США) в течение 5 мин при 25 °С. Детергент удаляли, промывали физиологическим раствором 3 раза и вносили по 50 мкл на лунку раствора фаллоидина, меченного родамином («Invitrogen», США), в соответствии с протоколом производителя. После чего клетки инкубировали в термостате 10 мин при температуре 37 °С, промывали физиологическим раствором 3 раза, высушивали и наносили среду для заключения, содержащую ядерный краситель DAPI («Invitrogen», США). Покровные стекла хранили в холодильнике при температуре 4 °С в фольге. Препараты анализировали с помощью микроскопа «Axio Observer. D1» («Zeiss», Германия) и программы «AxioVision Rel. 4.7» («Zeiss», Германия).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "cytokines.ru" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск cytokines.ru, 2008 год.