Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2008, № 2
|
Оригинальные статьи
|
Номер 2'2008
|
ИНДУКЦИЯ АНТИТЕЛ К IFN? И IL-4 У МЫШЕЙИММУНИЗАЦИЕЙ ПЕПТИДАМИ, ВОСПРОИЗВОДЯЩИМИ ИММУНОДОМИНАНТНЫЕ В-ЭПИТОПЫ
С.В. Шевелев, А.Н. Митин, С.М. Андреев, А.А. Ярилин
С помощью комплекса компьютерных программ рассчитаны иммунодоминантные В-эпитопы молекул IFN? и IL-4 мыши. Синтезированы пептиды, соответствующие по аминокислотной последовательности некоторым из этих эпитопов - 99-113 из IFN?, 21-40 и 60-70 из IL-4. Конъюгатами названных пептидов с гемоцианином иммунизировали мышей. Практически у всех мышей при этом индуцировались антитела, реагирующие, по данным иммуноферментного анализа, с пептидами 99-113 из IFN? и 21-40 из IL-4; использование для иммунизации пептида 21-40 оказалось менее эффективным. При иммунизации пептидом из IFN? антитела, реагирующие с целой молекулой цитокина, индуцированы у 10 из 12 мышей, при иммунизации пептидом из IL-4 - у половины мышей. Активность антител по отношению к целой молекуле цитокина и его фрагменту, использованному для иммунизации, коррелировала. Антитела сохранялись в циркуляции мышей на достаточно высоком уровне активности в течение месяца и долее. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 2. С. 23-27.)
Ключевые слова: интерферон gamma, интерлейкин-4, антитела, пептиды.
В настоящее время широко разрабатываются методы антицитокиновой терапии, направленные на лечение заболеваний, патогенетическим фактором которых является усиление выработки тех или иных цитокинов или их дисбаланс [1, 2]. Потенциальной областью применения подходов, основанных на связывании цитокинов или ингибировании их активности, являются заболевания, в развитии которых важная роль принадлежит дисбалансу Th1- и Th2-клеток [5], в частности, аллергических заболеваний, при которых превалирует активность Th2-клеток и продуцируемых ими цитокинов [3, 6]. Одним из возможных путей поисков в данном направлении является индукция эндогенных антител к ключевым цитокинам Th1- и Th2-клеток.
В данной работе представлены результаты экспериментов по индукции антител к цитокинам путем иммунизации их пептидными фрагментами. Использование пептидов вместо целых молекул цитокинов продиктовано стремлением не нарушать цитокиновый баланс организма в процессе иммунизации, а также избежать побочных токсических эффектов цитокинов.
Материалы и методы
Для предсказания четвертичной структуры белков и расчета иммунодоминантных В-эпитопов использованы компьютерные программы Peptide Companion v. 1.231, A3-D Viewer for National Center for Biotechnology Information Databases Version 3.0 и Swiss-Pdb Viewer v.3.7b2. При этом учитывались следующие параметры: гидрофобность, "доступность больших сфер", гидропатичность и локализация сгибов ?-слоев, отсутствие сайтов гликозилирования, наличие в структуре остатков ароматических аминокислот [4]. Основанием для определения локализации эпитопа являлось совпадение на определенном участке полипептидной цепи всех или большинства этих свойств.
В твердофазном синтезе пептида использовали стартовый Fmoc-Asn(Trt)-полимер (смола Wang от NovaBiochem, 0,44 ммоль/г) и производные аминокислот, где гидроксильные и карбоксильные группы защищались трет-бутильной группой (t-Bu), амидные функции - Trt, ?-аминогруппа лизина - Boc, гуанидиновая группа аргинина - Mtr. Стандартный цикл включал промывку смолы диметилформамидом (ДМФ), удаление Fmoc-защиты (20 % пиперидин в ДМФ), предварительное активирование Fmoc-аминокислоты (DCC/HOBt) и конденсацию в среде ДМФ/N-метилпирролидон при 4-кратном избытке карбоксильного компонента (~1,5 часа). Контроль за полнотой реакции проводили нингидриновым методом и при необходимости реакцию конденсации повторяли. Промежуточные пептиды анализировали на аминокислотном анализаторе (Biotronik L5001). Отщепление пептида от смолы проводили трифторуксусной кислотой в присутствии скавенджеров (тиоанизол, этандитиол, фенол), пептид осаждали сухим серным эфиром, экстрагировали водной уксусной кислотой и экстракт лиофилизировали.
Первичную очистку пептида проводили дву-кратной гель-хроматографией на смоле Toyopearl HW40 (колонка: 2,5???78 см, элюент - 0,1 % раствор NH3, 60 мл/час; детектор LKB Uvicord SII, 254 нм). Сырую фракцию, идентифицированную по данным аминокислотного анализа, очищали градиентной ВЭЖХ (система Gilson/Data system, детектор Spectroflow 57 при 254 нм, интегратор Shimadzu C-R3A) с использованием колонки с Zorbax ODS 0,94???25 см ("DuPont Сhromatography"). Дальнейший анализ проводили с помощью аналитической ВЭЖХ (Vydec C18, 0,4???25 см) в тех же условиях.
Для получения конъюгата пептидного фрагмента мышиного IFN? с гемоцианином улитки (KLH, "Calbiochem", USA) 5 мг пептида (мIL-4 60-70) растворяли в 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера (рН 9,0) и раствор смешивали с 800 мкл раствора 12,5 мг KLH в ФБ. Смесь перемешивали 30 мин и охлаждали до 4 °С. Добавляли 1,5 мкл охлажденого до 4 °С раствора глутарового альдегида ("Serva", Germany) в 250 мкл фосфатного буфера; реакционную смесь перемешивали 1 час и оставляли на 22 часа при 4 °С. Затем добавляли охлажденный раствор 10 мг NaBH4 ("Sigma", USA) в 400 мкл дистиллированной воды и оставляли на 1 час при комнатной температуре. Все содержимое переносили в диализную трубку (Servapore, 16 мм) и проводили исчерпывающий диализ против дистиллированной воды. Полученный диализат замораживали и лиофилизовали. Выход составлял 15,5 мг белого порошка, содержание пептида около 250 мкг/мг конъюгата.
Для иммунизации использованы мыши линии BALB/c и гибриды (СBA???С57Bl/6)F1 массой 20-22 г, полученные из питомника РАМН "Столбовая" и содержавшиеся на обычном пищевом рационе. Для индукции антител к цитокинам мыши в качестве иммуногенов использовали их пептидные фрагменты (пептид 99-113 из IFN? мыши и пептиды 21-40 и 60-70 из IL-4 мыши) или их конъюгаты с гемоцианином в дозе 30 мкг на мышь (в пересчете на пептид). Иммуногены вводили внутримышечно трехкратно с интервалом в 1 мес.; первое введение антигена осуществляли в полном, два следующие - в неполном адъюванте Фрейнда. Мышам контрольной группы вводили соответствующий адъювант без иммуногена в те же сроки, в которые иммунизировали животных из группы опыта.
Антитела к пептидам или целой молекуле IL-4 определяли в сыворотке крови мышей с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для постановки реакции использовали 96-луночные планшеты Titertek (Finland). На поверхности лунок общепринятым методом фиксировали антиген (IL-4, IFN? или их пептидные фрагменты); для этого добавляли 100 мкг раствора соответствующих пептидов или белка в концентрации 10 мкг/мл на 40 мМ карбонат-бикарбонатном буфере, рН 8,3. Затем в лунки добавляли 100 мкл сыворотки крови в серийных разведениях (обычно двукратных, начиная с 1:100) на фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР), рН 7,4. После инкубации и отмывания в лунки вносили 100 мкг конъюгата козьих антител к IgG мыши с пероксидазой на ФСБР. Ставили цветную реакцию на пероксидазу с о-фенилендиамином. Интенсивность окрашивания оценивали на ИФА-ридере (MultiskanEX "Labsystems", Finland) при длине волны 492 нм. Как правило, оценивали 3 показателя: оптическую плотность (ОП) в ИФА при разведении сывороток 1:100, титр антител (последнее разведение, при котором ОП превышала 0,25) и долю животных, сыворотка которых содержала антитела с этим уровнем связывания лигандов.
Результаты обрабатывали методами вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel; вычисляли критерий t Стьюдента и коэффициент корреляции.
Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Начата подписка на 2016 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
