Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
Журнал 'Цитокины и воспаление', 2017, № 3
|
Краткие сообщения
|
Номер 3'2017
|
Моноклональные антитела против рецептора антимюллерова гормона человека как новый инструмент для диагностики и терапии рака
А.Я. Рак, А.В. Трофимов, Н.В. Пигарева, А.С. Симбирцев, А.М. Ищенко
Работа посвящена получению панели моноклональных антител мыши к рецептору антимюллерова гормона (АМГ) II типа – MISRII – а также исследованию их свойств. Показано, что полученные антитела обладают способностью к распознаванию внеклеточной части MISRII в составе не только рекомбинантной химерной конструкции, но и природного MISRII, что приводит к снижению эффективности индукции активированным рекомбинантным АМГ апоптоза в клетках-мишенях. Разработанная панель антител может быть использована как для создания нового инструмента для диагностики опухолей, так и для адресной доставки лекарственных агентов к MISRII-позитивным раковым клеткам (Цитокины и воспаление. 2017. Т. 16. № 3. С. 58–61.)
Ключевые слова: антимюллеров гормон, АМГ, противоопухолевая активность, рецептор, MISRII, AMHR2.
Антимюллеров гормон (АМГ) — гликопротеин суперсемейства цитокинов трансформирующего фактора роста-β (TGF-β), имеющий молекулярную массу около 140 кДа. Он является одним из ключевых факторов, определяющих пол и регулирующих функционирование репродуктивной системы у млекопитающих [1]. В начале XXI века было показано, что рекомбинантный АМГ (рАМГ) способен угнетать рост клеточных культур, происходящих из некоторых опухолей человека, клетки которых несут на своей поверхности специфические рецепторы АМГ II типа – MISRII, или AMHR2. Связывание с ними гормона служит сигналом к запуску сигнального пути с участием АМГ и реализации сигнального каскада с участием белков семейства SMAD, что, в конечном счете приводит к изменению экспрессии генов-эффекторов [6].
Рецептор MISRII специфичен исключительно к АМГ, в связи с чем этот поверхностный маркер может быть использован для адресной доставки рАМГ или цитостатиков в комплексе с антителами против MISRII к опухолевым клеткам-мишеням. Кроме того, антитела против MISRII могут быть использованы для диагностики ряда злокачественных новообразований. В настоящей работе была получена панель мышиных моноклональных антител к внеклеточной части рецептора MISRII и исследованы их свойства.
Материалы и методы
В экспериментах были использованы высокоочищенные препараты активированного рАМГ и химерного белка MISRII+Fc, состоящего из внеклеточной части MISRII и Fc-фрагмента иммуноглобулина IgG1 человека, полученные по ранее разработанным методикам, а также созданная на их основе система тестирования функциональной активности рАМГ [2]. Для получения моноклональных антител использовали самцов мышей линии Balb/c. Исследование влияния антител на рАМГ-зависимую индукцию апоптоза проводили на клетках легкого норки линии NBL-7 (ATCC, США).
Иммунизации животных антигеном с интервалом в 30 дней проводили в подошвенный апоневроз задних конечностей из расчета 50 мкг эмульгированного белка MISRII+Fc на мышь. Гибридомы получали по методу Мильштейна — Келера, для чего лимфоциты животных, взятые на 4-е сутки после повторной иммунизации, смешивали с клетками миеломы мыши линии Sp2/0 (из расчета 50000 клеток на лунку 96-ячеечного планшета) в соотношении 2:1 в присутствии полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 Да. Культивирование клеток после слияния проводили в селективной среде НАТ в планшетах с суточными перитонеальными макрофагами мыши. Первичный скрининг клонов проводили через 10 дней, используя в качестве антигена белок MISRII+Fc (сорбция в концентрации 1,5 мкг/мл в течение 20 часов в 20 мМ боратном буфере во влажной камере при комнатной температуре), а в качестве вторичных антител — антитела козы против Fc-фрагмента иммуноглобулинов IgG мыши («Sigma», США), конъюгированные с пероксидазой хрена (в разведении 1:4000). Вторичный скрининг для исключения клонов, продуцирующих антитела, специфичные к Fc-фрагменту, проводили, сорбируя в тех же условиях химерный белок Этанерсепт, состоящий из рецептора фактора некроза опухоли-альфа и Fc-фрагмента иммуноглобулина IgG1 человека. Клетки клонов, отобранных по итогам двух этапов скрининга и получивших наименование MIR-1, MIR-2, MIR-3 и MIR-4, реклонировали, а затем культивировали во флаконах площадью 125 см2 для внутрибрюшинного введения животным (из расчета 2 млн. клеток на мышь). Выделение антител панели MIR проводили из асцитной жидкости мышей, собранной спустя 10 суток после внутрибрюшинного введения клеток гибридом, с помощью метода аффинной хроматографии на белке А с использованием сорбента MabSelect («GE», США) по протоколу, предложенному производителем. Очищенные препараты антител подвергали диализу против 0,9% раствора NaCl.
Электрофоретическое разделение белков проводили по ранее описанной методике [7]. В работе использовали разделяющий гель с градиентной концентрацией акриламида 4-20% и концентрирующий гель с концентрацией акриламида 5%. Результаты электрофореза визуализировали с помощью стандартного окрашивания раствором Кумасси G-250. В ряде случаев анализ результатов электрофоретического разделения проводили с помощью вестерн-блота по стандартному протоколу [5]. Для переноса белков использовали нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм. Концентрация первичных антител составила 5 мкг/мл, антивидового конъюгата с пероксидазой хрена («Sigma», США) — 0,5 мкг/мл. Для проявления окрашивания использовали 0,05% раствор диаминобензидина (ДАБ) («Sigma», США) в ФБ, содержащем 1% диметилсульфоксида («Sigma», США) и 1% перекиси водорода (ООО «НеваРеактив», Россия).
Для исследования жизнеспособности клеток проводили МТТ-тестирование («Thermo Fisher Scientific») по протоколу, предложенному производителем, на 4-е сутки культивирования с предварительной 2-х часовой инкубацией лунок, содержащих антитела группы MIR.
Результаты и обсуждение
Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!
Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья
|
Подпишитесь на журнал "Цитокины и Воспаление" он-лайн!
Начата подписка на 2018 год!
Обновление на книжной полке: компакт-диск Цитокины и воспаление, 2008 год.
|
![[О компании] Издательство 'Цитокины и воспаление' - Журнал 'Цитокины и Воспаление'](/images/Logo.gif){kind=logo}
