E-mail: [email protected]
Web: cytokines.ru

  

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Журнал 'cytokines.ru', 2017, № 3

Оптимизация метода очистки IL-36Ra от липополисахаридов с помощью разделения фаз с Triton X-114

А.А. Колобов, Р.С. Калинин, Н.В. Скворцов, Е.В. Кондратьева, В.Е. Стефанов, А.В. Петров, А.С. Симбирцев

Цель исследования: оптимизировать метод разделения фаз вода : детергент Triton X-114 для очистки от липополисахаридов (ЛПС) рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина 36 (IL-36Ra). Материалы и методы: рекомбинантный IL-36Ra получен от продуцента на основе E. coli и очищен хроматографически. Очистку от ЛПС проводили с помощью разделения фаз вода : Triton X-114 в различных условиях. Примесь ЛПС определяли с помощью набора «ChromoLAL» («Cape Cod», США). Остаточный Triton X-114 удаляли с помощью диализа. Примесь Triton X-114 количественно определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ. Результаты: оптимизированная методика очистки IL-36Ra подразумевает двукратный цикл обработки проб 0,125 % Triton X-114, инкубацию 30 мин при +4 °С, нагревание проб до температуры +30 °С до полного помутнения образца и центрифугирование в течение 1 мин при 5000 g в нагретом до +25 °С роторе. Потери IL-36Ra составляют 10 %, конечная концентрация ЛПС — менее 5 EU/мл. Конечная концентрация Triton X-114 после диализа составляет 0,04 % по ОФ-ВЭЖХ. Заключение. В данной работе показано применение метода разделения фаз вода : Triton X-114 для очистки IL-36РRa от ЛПС, а затем и от остаточных количеств Triton X-114, подробно описаны возможности, ограничения и особенности практического применения метода. Материалы статьи будут полезны исследователям, желающим применить этот метод очистки от ЛПС к объектам своего исследования. (cytokines.ru. 2017. Т 16. № 3. С. 11–17.)

Ключевые слова: ЛПС, эндотоксин, тритон Х-114, двухфазная система, IL-36Ra.

Липополисахариды (ЛПС, эндотоксины) — структурные элементы клеточной стенки грам-отрицательных бактерий. Для человека и других животных ЛПС обладают токсическим и пирогенным эффектами. При лизисе бактериальных клеток ЛПС могут попадать в раствор. Поскольку многие современные лекарственные препараты представляют собой рекомбинантные белки, получаемые в бактериальных продуцентах, при их производстве неизбежна контаминация ЛПС хотя бы на начальных стадиях процесса очистки [20, 26]. Однако для применения в медицинских целях препараты должны быть очищены от эндотоксинов.

Все методики, применяемые для удаления ЛПС из растворов, так или иначе используют физико-химические свойства ЛПС — отрицательный заряд его углеводного компонента или гидрофобность его липидного компонента. Применяют в основном хроматографические методики: анионообменную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатитных сорбентах, гидрофобную хроматографию, отмывание связанного с колонкой белка раствором детергента или органического растворителя, а также аффинную хроматографию с сорбентами, на которых иммобилизованы селективно связывающие ЛПС лиганды, такие как полимиксин [3, 5–7, 16, 25, 28, 34]. Эти методы хорошо описаны, удобны в применении и, как правило, какой-нибудь из них или их комбинация позволяют достичь удовлетворительной очистки от ЛПС с умеренными потерями основного вещества для большинства белковых препаратов [22].

Но существуют белки, для очистки от ЛПС которых вышеописанные методы неэффективны или неудобны в силу различных причин. Например, ЛПС может быть связан с молекулой белка, который требуется очистить. Это распространенный случай для белков с гистидиновыми аффинными метками [18]. В других случаях природа конкретного белка накладывает ограничения на условия работы с ним. В ходе нашей работы по получению рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина 36 (IL-36RA) с помощью штамма-продуцента на основе E. coli мы столкнулись именно с такой проблемой. IL-36RA химически нестабилен при значениях рН, отличающихся от нейтрального, при которых он почти не заряжен, что делает невозможным эффективное применение ионообменной хроматографии. В то же время он высокогидрофобен, поэтому очистка его от ЛПС с помощью гидрофобных и аффинных сорбентов приводит к большим потерям.

IL-36RA является противовоспалительным цитокином, регулирующим воспаление в коже [9]. Введение экзогенного IL-36RA может быть перспективным подходом к терапии воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз [19]. Однако для его тестирования в моделях кожного воспаления и дальнейшего применения как лекарства требуется получать апирогенный препарат.

Удобным и эффективным методом очистки его от ЛПС оказалась так называемая двухфазная система на основе Triton X-114.

В этом методе раствор разделяют на две несмешивающиеся фазы, только одна из которых содержит ЛПС. Для этого в раствор вводят детергент Triton X-114, охлаждают раствор до +4 °С для увеличения растворимости детергента, затем раствор нагревают выше температуры помутнения этого детергента (+23 °С). В этот момент его растворимость в воде критически снижается, и он образует мицеллы, в которые включается также ЛПС. Мицеллы отделяются от раствора центрифугированием. В итоге Triton X-114 с ЛПС скапливается внизу пробирки в виде отдельной гидрофобной фазы, которая не смешивается с верхней водной фазой, содержащей белок.

Условия работы этой системы, описанные в оригинальной статье и ряде последующих статей, неоптимальны для некоторых белков, т. к. они могут быть повреждены или потеряны в процессе обработки [1, 4, 14]. Это определяет необходимость оптимизации метода для каждого конкретного случая. Впрочем, возможности модификации метода очень широки. Например, двухфазные системы с использованием Triton X-114 и других детергентов применяются также для очистки от ЛПС плазмидной ДНК и выделения некоторых белков [13, 17, 24, 31].

Отдельным недостатком метода является то, что после обработки в образце все же остается следовое количество Triton X-114. В зависимости от дальнейшего применения конкретного образца от этой примеси тоже бывает нужно избавиться.

Целью данной работы стала оптимизация метода двухфазной системы с Triton X-114 для очистки от ЛПС рекомбинантного IL-36RA из бактериального продуцента, включая метод очистки раствора от остаточных количеств Triton X-114 и количественного анализа примеси Triton X-114.

Материалы и методы

Получение IL-36RA

Штамм-продуцент E. coli BL21 Star [DE3] (IL-36Raf) культивировали в 1,5? среде LB в 1? среде M9 со 100 мкг/л ампициллина при +37 °С в культурах объемом 200 мл в 2 л колбах до плотности 3 ОЕ/мл. Индукцию гена IL-36RA проводили 0,1 мМ изопропил-b D-1-тиогалактопиранозидом ( ИПТГ) в течение 3 часов при +30 °С. Биомассу бактерий собирали центрифугированием, лизировали замораживанием и размораживанием и разводили в 50 мМ трис, рН 7,0. Дебрис удаляли центрифугированием. Очистку IL-36RA проводили в два этапа. Сначала полученный лизат наносили на сорбент Q XL (GE, США) в 50 мМ трис, рН 7,0. Несвязавшуюся фракцию собирали, добавляли сульфат аммония до 0,3 М и наносили на сорбент Toyopearl Butyl-650S (Tosoh, Япония). Элюировали IL-36RA 50 мМ фосфатом натрия, рН 6,0. Все дальнейшие манипуляции проводили с одним образцом IL-36RA, выделенным хроматографически за один раз из биомассы от одного культивирования. Концентрация IL-36RA в образце составляла 2 мг/мл.

Очистка от липополисахаридов с помощью Triton X-114

В работе использовали апирогенные пробирки и носики для пипеток. Анализировали 3 группы по 3 образца. К образцам добавляли стоковый 10 % раствор Triton X-114 из расчета 25 или 12,5 мкл раствора на 1 мл образца и перемешивали пипетированием. Затем образец инкубировали 30 мин на ледяной бане, 10 мин в твердотельном термостате при температуре +30 °С или +37 °С до помутнения раствора. Помутнение раствора указывало на потерю Triton X-114 растворимости в воде в текущих условиях. После этого для отделения фракции мицелл Triton X-114 центрифугировали пробирки при 5000 g в течение 5 мин. Верхнюю водную фазу переносили в чистую апирогенную емкость, также отбирали образец для анализа. Процедуру повторяли 2 раза. При повторах вносили уменьшенное количество Triton X-114 с учетом потерь объема образца. Объем определяли с помощью весов, плотность раствора считали равной плотности воды.

Определение концентрации белка в растворе проводили с помощью набора «Pierce BCA Protein Assay Kit» («Thermo Fisher Scientific», США) по протоколу производителя после диализа проб.

Количественное определение примеси ЛПС проводили с помощью набора «ChromoLAL» («Cape Cod Inc.», США) по протоколу производителя.

Определение примеси Triton X-114

Количественный анализ примеси Triton X-114 в образцах IL-36RA проводили методом ОФ-ВЭЖХ на колонке Waters DeltaPak C18. 10 мкг IL-36RA в 25 мкл раствора наносили на колонку в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,0. Элюцию проводили 70 % ацетонитрилом в 0,1 % трифторуксусной кислоте, рН2,5, за 5 мин при скорости потока 1 мл/мин и температуре +35°С. Детектирование проводили на УФ-детекторе при длине волны 220 нм. В качестве стандартного образца для сравнения использовали 25 мкл 0,001 % раствора Triton X-114 в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,0. Количество Triton X-114 в образцах IL-36RA определяли сравнением площадей пиков, соответвующих Triton X-114, в стандартном и исследуемом образце. Площади пиков определяли с помощью программы «МультиХром 1,52» («Амперсанд», Россия).

Диализ для удаления примеси Triton X-114

Очистку растворов IL-36RA от Triton X-114 проводили с помощью диализа против 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,0. Коэффициент разбавления составлял 500?. Раствор IL-36RA помещали в диализный мешок MFPI CelluSep T2 MWCO 6-8 kDa («MFPI», США), фиксировали клипсами на обоих концах, помещали в стеклянный стакан, заполненный количеством буфера, необходимым для достижения нужного коэффициента разбавления. Содержимое стакана перемешивали на магнитной мешалке при температуре +4°С в течение ночи.

Статистическую обработку результатов проводили в программе «Prizm 6» («GraphPad Software», США).

Результаты и обсуждение

Читайте статью целиком
в печатной версии журнала!

Содержание | Следующая статья | Предыдущая статья

Подпишитесь на журнал "cytokines.ru" он-лайн!


Начата подписка на 2018 год!

Обновление на книжной полке: компакт-диск cytokines.ru, 2008 год.